ICS 07.140 CCS C06 SF 中 华 人 民 共 和 国 司 法 行 政 行 业 标 准 SF/T 0133—2023 HRM用于致幻蘑菇古巴光盖伞种属鉴定技 术规范 Technical specification for species identification of Psilocybe cubensis of hallucinogenic mushroom by high -resolution melting (HRM) method 2023 - 10 - 07发布 2023 - 12 - 01实施 中华人民共和国司法部 发布 SF/T 0133 —2023 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 缩略语 ................................ ................................ ............. 1 5 总体要求 ................................ ................................ ........... 1 6 检验程序 ................................ ................................ ........... 2 7 鉴定意见 ................................ ................................ ........... 3 8 鉴定文书 ................................ ................................ ........... 4 附录A（资料性） 致幻蘑菇古巴光盖伞（阳性对照样本）的 HRM检测曲线峰型与 Tm值结果 ...... 5 附录B（资料性） 致幻蘑菇古巴光盖伞（阳性对照样本）在 7个目标区域的序列信息 ........... 6 参考文献 ................................ ................................ .............. 7 SF/T 0133 —2023 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 司法鉴定科学研究院 提出。 本文件由 司法部信息中心 归口。 本文件起草单位： 司法鉴定科学研究院、复旦大学、深圳海关动植物检验检疫技术中心。 本文件主要起草人： 张素华、李成涛、张晓春、夏若成、陶瑞旸、陈安琪、郑晓聪、施妍、陈航。 SF/T 0133 —2023 1 HRM用于致幻蘑菇古巴光盖 伞种属鉴定技术规范 1 范围 本文件规定了基于高分辨率熔解曲线分析对致幻蘑菇古巴光盖伞进行种属鉴定的 总体要求、检验 程序、鉴定意见和鉴定文书 。 本文件适用于实验室采用高分辨率熔解曲线分析对致幻蘑菇古巴光盖伞进行种属鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 SF/T 0069 法医物证鉴定实验室管理规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 致幻蘑菇 hallucinogenic mushroom 一类子实体和 /或菌丝体内含有活性色胺类毒素， 能引起人或动物产生神经致幻性中毒的大型真菌。 古巴光盖伞 psilocybe cubensis 归属于真菌界 -担子菌门 -担子菌纲 -伞菌目 -球盖菇科 -光盖伞属，含有神经致幻型毒素 （如赛洛西宾 和赛络新等 ），一般食后不久会产生精神极度愉快、狂欢乱舞、情绪焦虑 和自控力降低等症状 的真菌。 注： 在中国，该类致幻蘑菇属于管制的精神类毒品。 高分辨率熔解曲线 high-resolution melting ；HRM 一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析技术 。 注： 高分辨率 熔解曲线具有极高的敏感性，能检测出单个碱基的差异。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic Acid ） ITS：内转录间隔区域（ Internally Transcribed Spacer ） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ） Tm：熔解温度（ Melting Temperature ） 5 总体要求 鉴定机构 应具有从事法医物证的执业范围，且应满足如下要求： a) 对所有影响鉴定结果的人员岗位规定相应的能力要求，包括教育、资质、培训、专业知识和技 能等,并保留相关记录，制定适宜的培训计划并组织实施； b) 依据第6章～第8章的规定， 对鉴定人以及参与鉴定工作的人员进行监督，以评价其鉴定工 作的符合性和满意程度，监督的结果作为培训需求评价的依据之一； c) 具有能识别样本的标识系统，并确保样本在鉴定过程期间能得到持续的识别； SF/T 0133 —2023 2 d) 建立样本的运输、接收、处置、保护、存储、保留和 /或清理的规定，能对接收、内部传递、 处置、保留、返还和清理等过程进行 记录，确保记录的完整性和可追溯性。 鉴定人应具有法医物证鉴定执业资格，熟悉并掌握高分辨率熔解曲线分析的原理和操作，并能正 确使用相关分析软件对检测结果进行分析与评价。 鉴定活动应包括检验（采样、 DNA制备、高分辨率熔解曲线分析）、鉴定意见出具 和鉴定文书撰写 等环节。鉴定活动完毕后，应将各个环节的记录进行归档。 实验室的基本要求以及样本管理、设备管理、质量管理等应符合 SF/T 0069 的规定。 6 检验程序 采样 样本的采集、包装和保存要求如下： a) 样本可以是菌盖、菌柄或菌托，也可为孢子或 其它制品等。有条件的情况下，宜选择新鲜的检 材； b) 样本应分别包装，外包装袋上 应注明检材编号、检材外观及状态、采样地点、采样时间和采样 人等； c) 样本采集后应干燥保存。 DNA制备 6.2.1 样本前处理 应将待测样本剪碎，经液氮速冻进行研磨粉碎，充分破坏组织的细胞壁。有条件的情况下， 宜选取 样本的内部组织部分，以避免污染。 6.2.2 DNA提取与定量 宜采用商业化 DNA提取试剂盒进行基因组 DNA的提取。宜采用荧光定量试剂盒进行 DNA定量。具体操 作步骤应按照相应的试剂盒说明书及仪器使用指南执行。 高分辨率熔解曲线分析 6.3.1 目标区域及引物信息 宜检测7个目标区域，分别为 ITS、ITS1、ITS2、RPB1（PC-R1）、tEF1α（PC-EF）、Psilocybin - related phosphotransferase gene （PC-PT）和Glyceraldehyde 3 -phosphae dehydrogenase gene （PC- 3）。推荐的 目标区域及引物信息见表 1。 表1 用于致幻蘑菇古巴光盖伞种属鉴定的目标区域及推荐的引物信息 目标区域 扩增引物序列（ 5’～3’） 扩增片段长度 bpa ITS F-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 723 R-TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS1 F-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 338 R-GCTGCGTTCTTCATCGATGC ITS2 F-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC 351 R-TCCTCCGCTTATTGATATGC PC-R1 F-CTCTACTCGTTTCGCACCC 247 R-CGCACTCCTCGTTCAGC PC-EF F-TTCATCAAGAAGGTCGGTTAC 68 R-TCTCCGTGCCATCCAG PC-PT F-ATCGGGAGGTTCTGGG 146 R-CGCAAGTGGCGGTTT SF/T 0133 —2023 3 表1 用于致幻蘑菇古巴光盖伞种属鉴定的目标区域及推荐的引物信息