2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 蛙 脑 膜 炎 诊 断 方 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 3 0 C C S B 7 2 4 6 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c m e t h o d s f o r f r o g m e n i n g i t i s S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T７２４６—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１１)归口. 本文件起草单位:浙江省淡水水产研究所、全国水产技术推广总站. 本文件主要起草人:潘晓艺、张翔、蔺凌云、沈锦玉、蔡晨旭、姚嘉赟、袁雪梅、黄雷、陈静、彭先启、黄小 红、尹文林. ⅠSC/T７２４６—２０２５ 蛙脑膜炎诊断方法 １　范围 本文件描述了蛙脑膜炎(frogmeningitis)诊断的试剂和材料、仪器设备、临床症状、样品,以及组织病 理检测、套式PCR检测、染料法qPCR检测和综合判定的方法. 本文件适用于米尔伊丽莎白菌引起的蛙脑膜炎的流行病学调查、诊断、检疫和监测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 SC/T７０１１􀆰１　水生动物疾病术语与命名规则　第１部分:水生动物疾病术语 SC/T７０１１􀆰２　水生动物疾病术语与命名规则　第２部分:水生动物疾病命名规则 SC/T７２０２􀆰３—２００７　斑节对虾杆状病毒诊断规程　第３部分:组织病理学诊断法 ３　术语和定义 SC/T７０１１􀆰１和SC/T７０１１􀆰２界定的以及下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 蛙脑膜炎　frogmeningitis 由米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingiamiricola)感染牛蛙(Ranacatesbeiana)、黑斑蛙(Pelophylax nigromaculatus)和棘胸蛙(Quasipaaspinosa)等蛙类,造成平衡机能失调、歪头、眼膜发白等症状的疾病. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(basepair) Ct:阈值循环数,即荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cycleＧthresholdvalue) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyＧribonucleosidetriphosphatemixture) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) qPCR:实时荧光定量PCR(quantitativerealＧtimePCR) Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus) TE:TrisＧEDTA Tris:三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane) ５　试剂和材料 ５􀆰１　水:符合GB/T６６８２中一级水的规格. ５􀆰２　乙醚:分析纯. ５􀆰３　氯仿:分析纯. ５􀆰４　异戊醇:分析纯. １SC/T７２４６—２０２５ ５􀆰５　二甲苯:分析纯. ５􀆰６　石蜡:病理级. ５􀆰７　粘片剂:生化试剂,避光室温保存. ５􀆰８　中性树胶:生化试剂,室温保存. ５􀆰９　琼脂糖:电泳级. ５􀆰１０　无水乙醇:分析纯. ５􀆰１１　乙酸铵:分析纯. ５􀆰１２　苏木精染色液:生化试剂,室温保存. ５􀆰１３　０􀆰５％伊红染色液:生化试剂,室温保存. ５􀆰１４　４％多聚甲醛固定液:生化试剂,室温保存. ５􀆰１５　７５％乙醇:生化试剂,室温保存. ５􀆰１６　Tris饱和酚(pH＞７􀆰８):生化试剂,避光４℃保存. ５􀆰１７　TaqDNA聚合酶(５U/μL):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰１８　dNTPs(各２􀆰５mmol/L):生化试剂,－２０℃保存. ５􀆰１９　１０×PCR缓冲液(无Mg２＋):生化试剂,－２０℃保存. ５􀆰２０　MgCl２(２５mmol/L):生化试剂,－２０℃保存. ５􀆰２１　DNAMarker:生化试剂,－２０℃保存. ５􀆰２２　核酸染料:生化试剂,４℃保存. ５􀆰２３　２×SYBRGreenqPCR预混液:商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰２４　酚/氯仿/异戊醇混合液:将Tris饱和酚、氯仿、异戊醇按体积比２５∶２４∶１混匀,４℃保存. ５􀆰２５　氯仿/异戊醇混合液:将氯仿、异戊醇按体积比２４∶１混匀,４℃保存. ５􀆰２６　抽提缓冲液:按A􀆰１配制. ５􀆰２７　蛋白酶K(２０mg/mL):按A􀆰２配制. ５􀆰２８　乙酸铵(１０mol/L):按A􀆰３配制. ５􀆰２９　TE缓冲液(pH８􀆰０):按A􀆰４配制. ５􀆰３０　５０×电泳缓冲液:按A􀆰５配制. ５􀆰３１　１×电泳缓冲液:按A􀆰６配制. ５􀆰３２　６×载样缓冲液:生化试剂,室温保存. ５􀆰３３　套式PCR引物:－２０℃保存.第一轮PCR引物分别是EMiＧ５７６F１和EMiＧ５７６R１,扩增E􀆰miriＧ colalepA基因中的５７６bp片段(见附录B中的B􀆰１);第二轮PCR引物分别是EMiＧ３０８F２和EMiＧ ３０８R２,从该片段中再扩增３０８bp的片段.引物序列如下: EMiＧ５７６F１:５′ＧAACCGCAATATCAAACTGTTGTCTAＧ３′; EMiＧ５７６R１:５′ＧTGTGGATTCCTTGGAATGCTGＧ３′; EMiＧ３０８F２:５′ＧAACCGCAATATCAAACTGTTGTCTAＧ３′; EMiＧ３０８R２:５′ＧGTGAAATCGTTAACCAAAGTTATTTGＧ３′. ５􀆰３４　染料法qPCR引物:－２０℃保存.扩增引物分别是EMiＧq１３７F和EMiＧq１３７R,扩增E􀆰miricola lepA基因中的１３７bp片段(见B􀆰２): EMiＧq１３７F:５′ＧCTCCTTCACATGCAGCGATTＧ３′; EMiＧq１３７R:５′ＧAATTACTATTAAAAGCCACGCAATTCAAＧ３′. ５􀆰３５　阳性对照:米尔伊丽莎白菌菌液,－２０℃保存. ５􀆰３６　阴性对照:未感染伊丽莎白菌的蛙组织,－２０℃保存. ５􀆰３７　空白对照:水. ２SC/T７２４６—２０２５ ６　仪器设备 ６􀆰１　包埋机. ６􀆰２　切片机. ６􀆰３　展片机. ６􀆰４　烤片机. ６􀆰５　光学显微镜. ６􀆰６　高速冷冻离心机:４℃离心力１２０００g以上. ６􀆰７　PCR仪. ６􀆰８　荧光定量PCR仪:具有SYBRGreenI荧光检测通道. ６􀆰９　水平电泳仪. ６􀆰１０　紫外观察仪或凝胶成像仪:波长范围２８０nm~３２０nm. ６􀆰１１　水浴锅或金属浴. ６􀆰１２　－２０℃普通冰箱. ６􀆰１３　电炉或微波炉. ６􀆰１４　微量移液器. ７　临床症状 病蛙反应迟钝离群独游,典型临床症状有头部歪斜、身体失衡、浮于水面打转、眼膜发白、眼球晶状体 不透明(见附录C中的图C􀆰１)等. ８　样品 ８􀆰１　对象 蝌蚪、幼蛙、稚蛙和成蛙,优先采集眼膜发白、歪头或打转症状的蛙(见图C􀆰１),并做好采样记录. ８􀆰２　数量 无症状的蝌蚪或蛙,采集至少１５０尾或只;有疑似临床症状的蝌蚪或蛙,不少于３０尾或只. ８􀆰３　器官或组织 体表用清水冲洗,再用７５％乙醇擦拭体表后,无菌操作方式,取脑、眼膜和心脏组织. ８􀆰４　运输保存条件 样品冷藏运送至实验室. ９　组织病理检测 ９􀆰１　取材与固定 将活蛙置于密闭容器中,再放入浸过乙醚或氯仿的脱脂棉.待麻醉后,取出用清水冲洗体表后,迅速 取脑和眼组织,切成厚度不超过３mm的组织块,用１０倍体积以上的４％多聚甲醛(５􀆰１４)进行组织固定 ２４h;同时,取健康蛙组织作为阴性对照. ９􀆰２　样品处理和观察 将固定后的样品转移至７０％乙醇中保存.切片制备程序按SC/T７２０２􀆰３—２００７中６􀆰２~６􀆰９的规定 执行.封片后,置于光学显微镜下观察组织病理变化. 蛙脑膜炎组织病理特征示例见附录C. ９􀆰３　结果判定 若脑膜组织出现脑膜炎(见图C􀆰２),或眼睛出现眼内炎,或角膜上皮增生(见图C􀆰３),则判定典型组 织病理特征为蛙脑膜炎阳性. ３SC/T７２４６—２０２５ １０　套式PCR检测 １０􀆰１　DNA提取 １０􀆰１􀆰１　取３０mg~５０mg组织样品,加入抽提缓冲液(５􀆰２６)５００μL,充分研磨,３７℃温浴１h.提取过程 同时设置阳性对照(５􀆰３５)和阴性对照(５􀆰３６). １０􀆰１􀆰２　加入２􀆰５μL２０mg/mL蛋白酶K(５􀆰２７),混匀后置于５０℃水浴３h. １０􀆰１􀆰３　将溶液冷却至室温,加入等体积Tris饱和酚(５􀆰１６),颠倒混合１０min,于１００００r/min离心 ３min,上层水相移至１􀆰５mL新离心管中. １０􀆰１􀆰４　加入等体积