2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 细 菌 性 肾 病 诊 断 方 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 7 2 4 5 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c m e t h o d s f o r b a c t e r i a l k i d n e y d i s e a s e S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T７２４５—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１１)归口. 本文件起草单位:北京市水产技术推广站、全国水产技术推广总站. 本文件主要起草人:王静波、张文、潘勇、张翔、徐立蒲、王小亮、曹欢、王姝、吕晓楠、蔡晨旭、江育林. ⅠSC/T７２４５—２０２５ 细菌性肾病诊断方法 １　范围 本文件描述了细菌性肾病(bacterialkidneydisease)诊断的试剂和材料、仪器设备、临床症状、样品,以 及组织印片检查、套式PCR检测和综合判定的方法. 本文件适用于鲑肾杆菌(Renibacteriumsalmoninarum)引起的鲑科鱼类细菌性肾病的流行病学调 查、诊断、检疫和监测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. SC/T７０１１􀆰１　水生动物疾病术语与命名规则　第１部分:水生动物疾病术语 SC/T７１０３　水生动物产地检疫采样技术规范 ３　术语和定义 SC/T７０１１􀆰１界定的以及下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 细菌性肾病　bacterialkidneydisease 由鲑肾杆菌感染引起的鲑科鱼类疾病. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. BKD:细菌性肾病(bacterialkidneydisease) bp:碱基对(basepair) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethyammoniumbromide) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyＧribonucleosidetriphosphatemixture) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus) TE:Tris盐酸和EDTA缓冲溶液(EDTATris􀅰HCl) Tris:三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane) ５　试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水. ５􀆰１　dNTPs(A、T、G、C四种碱基各１０mmol/L):－２０℃保存. ５􀆰２　DNA分子量标准溶液:－２０℃保存. ５􀆰３　核酸染料:４℃保存. ５􀆰４　琼脂糖:电泳级. ５􀆰５　TaqDNA聚合酶(５U/μL):－２０℃保存. １SC/T７２４５—２０２５ ５􀆰６　香柏油:常温保存. ５􀆰７　无水乙醇:常温保存. ５􀆰８　１０×PCR缓冲液(含Mg２＋,２５mmol/L):－２０℃保存. ５􀆰９　革兰氏染色液:按A􀆰１配制. ５􀆰１０　CTAB溶液:按A􀆰２配制. ５􀆰１１　抽提液Ⅰ:按A􀆰３配制. ５􀆰１２　抽提液Ⅱ:按A􀆰４配制. ５􀆰１３　TE缓冲液:按A􀆰５配置. ５􀆰１４　５×电泳缓冲液:按A􀆰６配制. ５􀆰１５　６×上样缓冲液:按A􀆰７配制. ５􀆰１６　阳性对照:已知感染鲑肾杆菌的鲑科鱼类组织样品,－２０℃~－８０℃保存. ５􀆰１７　阴性对照:已知未感染鲑肾杆菌的鲑科鱼类组织样品,－２０℃~－８０℃保存. ５􀆰１８　空白对照:蒸馏水. ５􀆰１９　第一轮PCR引物,－２０℃保存,引物序列如下: 引物F１:５′ＧAGCTTCGCAAGGTGAAGGGＧ３′; 引物R１:５′ＧGCAACAGGTTTATTTGCCGGGＧ３′. ５􀆰２０　第二轮PCR引物,－２０℃保存,引物序列如下: 引物F２:５′ＧATTCTTCCACTTCAACAGTACAAGGＧ３′; 引物R２:５′ＧCATTATCGTTACACCCGAAACCＧ３′. ６　仪器设备 ６􀆰１　普通冰箱. ６􀆰２　超低温冰箱:－８０℃及以下. ６􀆰３　显微镜. ６􀆰４　电子天平. ６􀆰５　微量组织研磨仪(器). ６􀆰６　水浴锅. ６􀆰７　高速冷冻离心机:最高转速１２０００r/min及以上,温度４℃. ６􀆰８　微量移液器. ６􀆰９　普通PCR仪. ６􀆰１０　水平电泳仪. ６􀆰１１　凝胶成像仪. ７　临床症状 患病鱼体色发黑,眼球突出.解剖后,肾脏出现直径２mm~４mm白色肉芽肿,见附录B中的图 B􀆰１;严重时肝脏、脾脏中也出现白色肉芽肿,见图B􀆰２和图B􀆰３. ８　样品 ８􀆰１　采样对象 鲑科鱼类. ８􀆰２　采样部位 ８􀆰２􀆰１　体长≥６cm的鱼,取肾脏、肝脏和脾脏. ２SC/T７２４５—２０２５ ８􀆰２􀆰２　体长４cm~６cm的鱼,取所有内脏. ８􀆰２􀆰３　体长≤４cm的鱼,取整条鱼;带卵黄囊的鱼去掉卵黄囊. ８􀆰３　采样数量 有临床症状的鱼采集１０尾~２０尾,无临床症状的鱼采集数量按SC/T７１０３的规定执行. ８􀆰４　保存及运送 采样应加贴标签,标签上清楚标明样品编号、采样时间、采样地点.做组织印片检查的样品应鲜活(濒 死)送达实验室,立即取样检测;不做组织印片的样品,冰鲜(冻)送达实验室. ９　组织印片检查 ９􀆰１　制片、染色与观察 取出有临床症状鲜活(濒死)鱼的肾(肝、脾)脏的病变组织,用解剖刀切开一个断面,用镊子夹着切开 后的组织,将断面置于洁净的载玻片上轻轻印一下,制成组织印片,自然晾干,革兰氏染色,晾干后,置于显 微镜载物台,滴加香柏油于印片,１００×物镜下观察. ９􀆰２　结果判定 观察到大量形态一致的革兰氏阳性小短杆菌,判定为疑似BKD. 革兰氏染色后,菌体呈紫色,判定为革兰氏阳性菌;革兰氏染色后,菌体呈红色,判定为革兰氏阴性菌. 染色后鲑肾杆菌菌体形态见图B􀆰４. １０　套式PCR检测 １０􀆰１　第一轮PCR １０􀆰１􀆰１　DNA提取 １０􀆰１􀆰１􀆰１　电子天平称取２５mg~１００mg组织样品,加入１５０μLCTAB溶液,用微量组织研磨仪(器)将 样品匀浆成糊状,转入１􀆰５mL灭菌离心管中.提取过程同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照. １０􀆰１􀆰１􀆰２　加入CTAB溶液至９００μL,上下颠倒混匀后置于２５℃水浴锅中水浴２h~２􀆰５h. １０􀆰１􀆰１􀆰３　加入６００μL抽提液Ⅰ(５􀆰１１),充分混匀３０s.置于高速冷冻离心机中,４℃１２０００r/min离心 ５min. １０􀆰１􀆰１􀆰４　吸取上层水相转移至新的１􀆰５mL灭菌离心管中,加入７００μL抽提液Ⅱ(５􀆰１２),充分混匀 ３０s.置于高速冷冻离心机中,４℃１２０００r/min离心５min. １０􀆰１􀆰１􀆰５　吸取上层水相转移至新的１􀆰５mL灭菌离心管中,加入１􀆰５倍体积的无水乙醇(－２０℃预冷) 倒置数次混匀,置于－２０℃冰箱放置８h. １０􀆰１􀆰１􀆰６　采用高速冷冻离心机,４℃１２０００r/min离心３０min,沉淀DNA,倾去上清液,室温晾干. １０􀆰１􀆰１􀆰７　向DNA沉淀中加TE缓冲液１００μL,待沉淀溶解,－２０℃冰箱保存备用. １０􀆰１􀆰１􀆰８　可采用同等抽提效果的其他方法或商品化DNA提取试剂盒. １０􀆰１􀆰２　反应体系 反应体系的配制应在洁净区完成.根据检测工作量需要配置１００份~１０００份反应预混液,１００份体 系组成见表１.加入除TaqDNA聚合酶和模板以外的各项试剂,在冰盒上配制成套式PCR中第一轮 PCR的无酶大体积预混物,充分混匀,分装保存于－２０℃.临用前,加入相应体积的TaqDNA聚合酶,混 匀,按１份/支分装到０􀆰２mLPCR管中.反应前,加入相应体积的模板量,混匀.其中,２５μL体系加模 板量２􀆰５μL/反应管;５０μL体系加模板量５􀆰０μL/反应管;１００μL体系加模板量１０􀆰０μL/反应管. 表１　第一轮PCR反应预混液所需试剂组成 成分 ２５μL体系 ５０μL体系 １００μL体系 试剂终浓度 １０×PCR缓冲液(Mg２＋) ２５０􀆰０μL ５００􀆰０μL １０００􀆰０μL １× ３SC/T７２４５—２０２５ 表１(续) 成分 ２５μL体系 ５０μL体系 １００μL体系 试剂终浓度 dNTPs(各１０mmol/L) ５０􀆰０μL １００􀆰０μL ２００􀆰０μL ０􀆰２mmol/L 引物F１(１０μmol/L) ５０􀆰０μL １００􀆰０μL ２００􀆰０μL ０􀆰２μmol/L 引物R１(１０μmol/L) ５０􀆰０μL １００􀆰０μL ２００􀆰０μL ０􀆰２μmol/L 蒸馏水 １８２５μL ３６５０μL ７３