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2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 - - 2 0 2 5 0 5 0 1 - - 实 施 虾 类 传 染 性 早 熟 病 毒 感 染 诊 断 方 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 : X X X X - X X X X I C S 6 5 . 0 2 0 . 3 0 C C S B 7 2 4 4 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c m e t h o d s f o r i n f e c t i o n w i t h i n f e c t i o u s p r e c o c i t y v i r u s o f p r a w n S C / T 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T7244—2025 前  言 本文件按照GB/T1􀆰1—2020«标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC156/SC11)归口. 本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、浙江省淡水水产研究所、湖州师范学院. 本文件主要起草人:董宣、潘晓艺、王国浩、黄倢、张庆利、邱亮、黄笑、蔺凌云、沈锦玉、杨国梁. ⅠSC/T7244—2025 虾类传染性早熟病毒感染诊断方法 1 范围 本文件描述了虾类传染性早熟病毒感染诊断的试剂和材料、仪器设备、临床症状、样品,以及组织病理 学检测、原位杂交检测、套式RTGPCR检测、RTGqPCR检测、RTGLAMP检测和综合判定的方法. 本文件适用于虾类传染性早熟病毒感染的流行病学调查、诊断、检疫和监测. 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T28630􀆰4—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第4部分:组织病理学诊断法 GB/T40257—2021 桃拉综合征诊断规程 RTGPCR检测法 SC/T7011􀆰1 水生动物疾病术语与命名规则 第1部分:水生动物疾病术语 SC/T7011􀆰2 水生动物疾病术语与命名规则 第2部分:水生动物疾病命名规则 3 术语和定义 SC/T7011􀆰1和SC/T7011􀆰2界定的术语和定义适用于本文件. 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件. AMV:禽类成髓细胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus) AP:碱性磷酸酶(alkalinephosphatase) BCIP:5G溴G4G氯G3G吲哚磷酸G甲苯铵盐(5GbromoG4GchloroG3GindolylphosphatepGtoluidinesalt) bp:碱基对(basepair) Ct值:阈值循环数,即荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cycleGthresholdvalue) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) DIG:地高辛(digoxigenin) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyGribonucleosidetriphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) IPV:传染性早熟病毒(infectiousprecocityvirus) MGMLV:莫洛尼鼠白血病病毒(moloneyGmurineleukemiavirus) NBT:氯化硝基四氮唑蓝(4Gnitrobluetetrazoliumchloride) PBS:磷酸缓冲盐溶液(phosphatebufferedsaline) PBST:含TweenG20的磷酸缓冲盐溶液(phosphatebufferedsalinewithTweenG20) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RTGLAMP:逆转录环介导等温扩增(reversetranscriptionloopGmediatedisothermalamplification) RTGPCR:逆转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction) RTGqPCR:实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionquantitativerealGtimepolyG merasechainreaction) SSC:柠檬酸钠缓冲液(salinesodiumcitrate) 1SC/T7244—2025 Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus) Tris:三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane) tRNA:转运RNA(transferRNA) 5 试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅适用确认为蒸馏水或去离子水或相当纯度的水. 5􀆰1 二甲苯:分析纯. 5􀆰2 无水乙醇:分析纯. 5􀆰3 95%乙醇:分析纯. 5􀆰4 石蜡(熔点52℃~54℃):切片级. 5􀆰5 中性树胶:生化试剂. 5􀆰6 琼脂糖:生化试剂. 5􀆰7 RNA保存液:生化试剂. 5􀆰8 DEPC水:按附录A中的A􀆰1配制. 5􀆰9 4%多聚甲醛固定液:按A􀆰2配制. 5􀆰10 85%乙醇:按A􀆰3配制. 5􀆰11 80%乙醇:按A􀆰4配制. 5􀆰12 75%乙醇:按A􀆰5配制. 5􀆰13 70%乙醇:按A􀆰6配制. 5􀆰14 50%乙醇:按A􀆰7配制. 5􀆰15 苏木精染色液:生化试剂. 5􀆰16 伊红G焰红染色液:按A􀆰8配制. 5􀆰17 原位杂交探针:用地高辛标记套式PCR第二步扩增的目标序列作为原位杂交的探针,序列见附录 B中的B􀆰1.合成时用DIG标记的核糖核苷尿嘧啶代替脱氧核糖核苷胸腺嘧啶残基. 5􀆰18 组织病理学和原位杂交检测阳性对照为感染IPV且有明显病理变化的罗氏沼虾复眼组织切片. 5􀆰19 组织病理学和原位杂交检测阴性对照为未感染IPV的正常罗氏沼虾复眼组织切片. 5􀆰20 蛋白酶K(20μg/mL):按A􀆰9配制. 5􀆰21 1×PBST:按A􀆰10配制. 5􀆰22 HCl(0􀆰2mol/L):按A􀆰11配制. 5􀆰23 无tRNA无肝素预杂交液:按A􀆰12配制. 5􀆰24 tRNA(5mg/mL):按A􀆰13配制. 5􀆰25 肝素(5mg/mL):按A􀆰14配制. 5􀆰26 预杂交液:按A􀆰15配制. 5􀆰27 1×马来酸:按A􀆰16配制. 5􀆰28 10%BlockingReagent:按A􀆰17配制. 5􀆰29 BlockingBuffer:按A􀆰18配制. 5􀆰30 2×SSC:按A􀆰19配制. 5􀆰31 0􀆰2×SSC:按A􀆰20配制. 5􀆰32 APG抗DIG(0􀆰75U/mL):按A􀆰21配制. 5􀆰33 1×AP反应缓冲液:生化试剂. 5􀆰34 BCIP/NBT显色液:按A􀆰22配制. 2SC/T7244—2025 5􀆰35 0􀆰5%俾斯麦棕Y:按A􀆰23配制. 5􀆰36 dNTPs(各2􀆰5mmol/L):含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2􀆰5mmol/L的混合物,-20℃保存. 5􀆰37 dNTPs(各10mmol/L):含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L的混合物,-20℃保存. 5􀆰38 5×MGMLV逆转录酶缓冲液:生化试剂,-20℃保存,或其他等效缓冲液. 5􀆰39 MGMLV逆转录酶(200U/μL):生化试剂,-20℃保存,或其他等效逆转录酶. 5􀆰40 RNA酶抑制剂(40U/μL):生化试剂,-20℃保存. 5􀆰41 随机引物(50μmol/L):生化试剂,-20℃保存. 5􀆰42 寡聚脱氧胸苷酸引物(50μmol/L):生化试剂,-20℃保存. 6􀆰43 TaqDNA聚合酶(5U/μL):生化试剂,-20℃保存,或其他等效DNA聚合酶. 5􀆰44 HotGStartTaqDNA聚合酶(5U/μL):生化试剂,-20℃保存,或其他等效DNA聚合酶. 5􀆰45 10×PCR缓冲液:生化试剂,无Mg2+,-20℃保存. 5􀆰46 MgCl2(25mmol/L):生化试剂,-20℃保存. 5􀆰47 AMV逆转录酶(10U/μL):生化试剂,-20℃保存,或其他等效逆转录酶. 5􀆰48 Bst3􀆰0DNA聚合酶(8U/μL):生化试剂,-20℃保存. 5􀆰49 套式RTGPCR两对引物:引物浓度为10μmol/L.其中,外侧引物IPVGF1和IPVGR1,扩增 1038bp片段;内侧引物IPVGF2和IPVGR2,扩增395bp片段.引物序列如下: 引物IPVGF1:5′GGCAGCACGTCCGCAAGCACGGTTGTCG3′; 引物IPVGR1:5′GCGCGGCGGTAAGTCTGCTAGCACGCTG3′; 引物IPVGF2:5′GTCCGCTAGGGCGAGGGGGAGTACGTGG3′; 引物IPVGR2:5′GAGCGTATGCCGGTGGGTGTGGGAGACG3′. 5􀆰50 RTGqPCR引物和探针:引物和探针浓度均为10μmol/L,引物和探针序列如下: 引物IPVGF

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