2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 对 虾 玻 璃 苗 弧 菌 病 诊 断 方 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 3 0 C C S B 7 2 4 3 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c m e t h o d f o r s h r i m p t r a n s l u c e n t p o s t - l a r v a v i b r i o s i s S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T７２４３—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１１)归口. 本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站. 本文件主要起草人:张庆利、刘爽、杨冰、冯东岳、万晓媛、张翔、徐婷婷、余星潼、王伟、谢国驷. ⅠSC/T７２４３—２０２５ 对虾玻璃苗弧菌病诊断方法 １　范围 本文件描述了对虾玻璃苗弧菌病(translucentpostＧlarvavibriosis,TPV)诊断的试剂和材料、仪器设 备、临床症状、样品,以及组织病理学检测、荧光定量PCR检测和综合判定的方法. 本文件适用于致玻璃苗弧菌(Vibriospp􀆰causingTPV)引起的对虾玻璃苗弧菌病的流行病学调查、 诊断、检疫和监测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB４７８９􀆰７　食品安全国家标准　食品微生物学检验　副溶血性弧菌检验 GB/T２８６３０􀆰２—２０１２　白斑综合征(WSD)诊断规程　第２部分:套式PCR检测法 GB/T２８６３０􀆰４—２０１２　白斑综合征(WSD)诊断规程　第４部分:组织病理学诊断法 SC/T７０１１　水生动物疾病术语与命名规则 SC/T７１０３—２００８　水生动物产地检疫采样技术规范 ３　术语与定义 SC/T７０１１界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. BＧ细胞:分泌细胞(blistercell) BC:细菌定殖(bacterialcolonization) BHQ１:黑洞荧光淬灭剂(blackholequencherＧ１) bp:碱基对(basepair) Ct值:阈值循环数,即实时荧光定量PCR检测中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cycleＧ thresholdvalue) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate) FＧ细胞:纤维细胞(fibrillarcell) FAM:羧基荧光素(６ＧCarboxyfluorescein) HE:苏木精Ｇ伊红染色法(hematoxylinＧeosinstaining) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) PFA:多聚甲醛固定液(paraformaldehydefixative) qPCR:实时荧光定量PCR(realＧtimequantitativepolymerasechainreaction) RＧ细胞:储存细胞(reservecell) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) Spv:沙门氏菌质粒毒力基因(Salmonellaplasmidvirulencegene) TAMRA:四甲基罗丹明叠氮化物(tetramethylrhodamine) Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus) １SC/T７２４３—２０２５ TcdB:艰难梭菌杀虫毒素B基因(ClostridiumdifficileinsecticideBgene) TPD:对虾“玻璃苗”(shrimptranslucentpostＧlarvadisease) TPV:对虾玻璃苗弧菌病(shrimptranslucentpostＧlarvavibriosis) VHVP:弧菌高毒力蛋白(vibriohighvirulentprotein) VIC:多管水母维多利亚绿色荧光蛋白(Aequoreavictoriagreenfluorescentprotein) VTPV:致对虾玻璃苗弧菌(Vibriospp􀆰causingTPV) vhvp:弧菌高毒力蛋白基因(vibriohighvirulentproteingene) vhvpＧ２:弧菌高毒力蛋白基因Ｇ２(vibriohighvirulentproteingeneＧ２) ５　试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用蒸馏水、去离子水或相当纯度的水. ５􀆰１　中性树胶. ５􀆰２　二甲苯:分析纯. ５􀆰３　９５％乙醇:分析纯. ５􀆰４　dNTPs(各２􀆰５mmol/L):dATP、dUTP、dGTP、dCTP各２􀆰５mmol/L的混合物,－２０℃保存. ５􀆰５　MgCl２(２５mmol/L),－２０℃保存. ５􀆰６　１０×PCR缓冲液,无Mg２＋离子,－２０℃保存. ５􀆰７　Taq酶(５U/μL),－２０℃保存. ５􀆰８　PFA固定液:按A􀆰１配制. ５􀆰９　苏木精染色液:按A􀆰２配制. ５􀆰１０　１％伊红储存液:按A􀆰３配制. ５􀆰１１　１％焰红储存液:按A􀆰４配制. ５􀆰１２　伊红Ｇ焰红染色液:按A􀆰５配制. ５􀆰１３　粘片剂:按A􀆰６配制. ５􀆰１４　８５％乙醇:按A􀆰７配制. ５􀆰１５　８０％乙醇:按A􀆰８配制. ５􀆰１６　７５％乙醇:按A􀆰９配制. ５􀆰１７　７０％乙醇:按A􀆰１０配制. ５􀆰１８　５０％乙醇:按A􀆰１１配制. ５􀆰１９　组织病理学检测阳性对照:受VTPV感染且显示明显病理变化的对虾仔虾肝胰腺组织切片. ５􀆰２０　组织病理学检测阴性对照:未受VTPV感染的健康对虾仔虾肝胰腺组织切片. ５􀆰２１　第一套引物和探针:引物与探针－２０℃保存;引物和探针序列为: vhvp_SpvBＧF１:５′ＧAGTCGTTTGGAGTATTGGGTGＧ３′; vhvp_SpvBＧR１:５′ＧGCCATCAGAGGTGTAGATCACＧ３′; vhvp_SpvBＧP１:５′Ｇ６ＧFAMＧTCTTCGAGTGCTGCGACCACTTTＧTAMRAＧ３′. ５􀆰２２　第一套引物和探针:引物与探针Ｇ２０℃保存;引物和探针序列为: vhvp_TcdBＧF２:５′ＧGTAATCGTTTGGTTAGCACCGＧ３′; vhvp_TcdBＧR２:５′ＧACCAAACCCACGGAACTCＧ３′; vhvp_TcdBＧP２:５′ＧVICＧCACGGCCATCCCAGACTCCATＧBHQ１Ｇ３′. ５􀆰２３　荧光定量PCR检测阳性对照:已知受VTPV感染的对虾肝胰腺组织DNA,或VTPV菌液DNA,或含 有SpvB、TcdB基因的质粒DNA,－２０℃以下保存. ５􀆰２４　荧光定量PCR检测阴性对照:VTPV检测阴性对虾组织DNA,－２０℃以下保存. ２SC/T７２４３—２０２５ ５􀆰２５　荧光定量PCR检测空白对照:灭菌双蒸水. ６　仪器设备 ６􀆰１　切片机. ６􀆰２　组织脱水机. ６􀆰３　包埋机. ６􀆰４　染色机. ６􀆰５　展片水浴锅. ６􀆰６　平板烘片机. ６􀆰７　封片机. ６􀆰８　光学显微镜. ６􀆰９　荧光定量PCR仪:具有FAM和VIC荧光通道. ６􀆰１０　高速离心机:最高转速不低于１２０００r/min. ６􀆰１１　微量移液器. ７　临床症状 患病的仔虾个体,空肠空胃、肝胰腺颜色变淡,幼体从头胸甲到腹节的体色由此变得通透和半透明. 见附录B中的B􀆰１. ８　样品 ８􀆰１　采样对象和要求 凡纳对虾(Penaeusvannamei)、中国对虾(P􀆰chinensis)和斑节对虾(P􀆰monodon)等易感品种,优先 选择濒死虾或具有TPV典型临床症状的个体.易感宿主种类和临床症状见附录B. ８􀆰２　采样数量、方法和保存运输 应符合GB/T２８６３０􀆰４—２０１２中附录B的规定. ８􀆰３　样品采集 ８􀆰３􀆰１　选取待分析的对虾样本,切取其肝胰腺和中肠组织,快速浸入４％PFA固定液中固定,１２h~２４h 后,换入７０％乙醇中长期保存. ８􀆰３􀆰２　开展荧光定量PCR检测采样时,按照SC/T７１０３—２００８中８􀆰２和８􀆰３的要求,幼虾或养成期对虾 应选取其肝胰腺、胃、中肠及后肠等组织样本,亲虾的非致死检测取粪便,仔虾或未达到０􀆰５g的样品可合 并样本.所取样品立即进行DNA提取,或暂存于９５％乙醇中,或保存于－２０℃. ８􀆰３􀆰３　对于待分离细菌的对虾样品,用无菌牙签从肝胰腺或中肠蘸取微量液体,按GB４７８９􀆰７—２０１３进 行分离和培养. ９　组织病理学检测 ９􀆰１　修块 对组织样品进行修整,按照GB/T２８６３０􀆰４—２０１２中附录B的要求,保证病灶部位能被有效地切片. ９􀆰２　脱水 将修块后的组织样品置于不同浓度乙醇溶液