2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 罗 氏 沼 虾 白 尾 病 诊 断 方 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 7 2 4 2 — 2 0 2 2 D i a g n o s t i c m e t h o d s f o r w h i t e t a i l d i s e a s e o f M a c r o b r a c h i u m r o s e n b e r g i i S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T７２４２—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC１５６)归口. 本文件起草单位:浙江省淡水水产研究所. 本文件主要起草人:潘晓艺、沈锦玉、蔺凌云、姚嘉赟、袁雪梅、林锋、黄雷、尹文林. ⅠSC/T７２４２—２０２２ 罗氏沼虾白尾病诊断方法 １　范围 本文件界定了罗氏沼虾白尾病(whitetaildisease,WTD)诊断的术语和定义,给出了缩略语、试剂和 材料、仪器和设备,描述了临床症状,规定了采样要求,以及组织病理检查、RNA提取、套式RTＧPCR检 测、RTＧqPCR检测和综合判定的方法. 本文件适用于罗氏沼虾白尾病的流行病学调查、诊断、检疫和监测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅 该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB/T２８６３０􀆰４　白斑综合征(WSD)诊断规程　第４部分:组织病理学诊断法 SC/T７０１１􀆰１　水生动物疾病术语与命名规则　第１部分:水生动物疾病术语 SC/T７０１１􀆰２　水生动物疾病术语与命名规则　第２部分:水生动物疾病命名规则 SC/T７１０３　水生动物产地检疫采样技术规范 ３　术语和定义 SC/T７０１１􀆰１和SC/T７０１１􀆰２界定的以及下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 罗氏沼虾白尾病　whitetaildisease,WTD 病原为罗氏沼虾野田村病毒,主要发生于罗氏沼虾仔虾淡化阶段,症状表现为第二或第三腹节处肌肉 不透明、坏死、分散的白浊斑点或不透明块,严重时全身肌肉呈乳白色. ３􀆰２　 罗氏沼虾野田村病毒　macrobrachiumrosenbergiinodavirus,MrNV 罗氏沼虾白尾病的病原,属于野田村病毒科未定属,二十面体对称结构,无囊膜,直径约２７nm,病毒基因 组为双节段单链正链RNA,可感染罗氏沼虾幼体和仔虾,引起肌肉白浊、全身乳白色等症状,造成大量死亡. ３􀆰３　 极小病毒　extrasmallvirus,XSV MrNV的卫星病毒,无独立感染能力,需在MrNV的帮助下进行复制,呈二十面体对称结构,无囊膜, 直径约１５nm,病毒基因组为单链RNA,分类地位未定. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. BHQ１:淬灭剂(blackholequencher１) bp:碱基对(basepair) Cq:定量循环(quantificationcycle) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyＧribonucleosidetriphosphatemixture) FAM:羧基荧光素(carboxyfluorescein) MＧMLV:莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) RTＧPCR:逆转录PCR(reversetranscriptionPCR) １SC/T７２４２—２０２２ RTＧqPCR:实时荧光RTＧPCR(reversetranscriptionquantitativerealＧtimePCR) Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus) ５　试剂和材料 ５􀆰１　水:蒸馏水、去离子水或相当纯度的水;RNA提取和cDNA合成应使用DEPC处理的水. ５􀆰２　TRIzolTM试剂:商品化试剂,４℃保存. ５􀆰３　dNTPs(各１０mmol/L):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰４　dNTPs(各２􀆰５mmol/L):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰５　５×MＧMLV逆转录酶缓冲液:商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰６　MＧMLV逆转录酶(２００U/μL):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰７　RNA酶抑制剂(４０U/μL):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰８　１０×PCR缓冲液(无Mg２＋):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰９　MgCl２(２５mmol/L):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰１０　TaqDNA聚合酶(５U/μL):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰１１　琼脂糖:电泳级. ５􀆰１２　核酸染料:商品化试剂,４℃保存. ５􀆰１３　DNAMaker:商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰１４　HotＧStartTaqDNA聚合酶(５U/μL):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰１５　MrNV套式PCR引物:引物浓度为１０μmol/L,－２０℃保存.第一轮PCR引物分别是 MrNV４２３F１和MrNV４２３R１,扩增MrNV衣壳蛋白基因中的４２３bp片段(见附录A中的A􀆰１);第二轮 PCR引物分别是MrNV２０５F２和MrNV２０５R２,从该片段中再扩增２０５bp的片段.引物序列如下: a)　MrNV４２３F１:５′ＧGCGＧTTAＧTAGＧATGＧGCAＧCAAＧGGＧ３′; b)　MrNV４２３R１:５′ＧAGCＧTGTＧGAAＧAYTＧTCCＧACTＧGGＧ３′; c)　MrNV２０５F２:５′ＧGATＧGACＧCCYＧAACＧGTTＧATCＧCTＧ３′; d)　MrNV２０５R２:５′ＧGTGＧTAGＧTMAＧCTTＧGCAＧAGAＧGGＧ３′. ５􀆰１６　XSV套式PCR引物:引物浓度为１０μmol/L,－２０℃保存.第一轮PCR引物分别是XSV５７３F１ 和XSV５７３R１,扩增XSV衣壳蛋白基因中的５７３bp片段(见A􀆰２);第二轮PCR引物分别是XSV２３６F２ 和XSV２３６R２,从该片段中再扩增２３６bp的片段.引物序列如下: a)　XSV５７３F１:５′ＧTCTＧAGCＧTGCＧTGAＧCGTＧTAAＧATGＧCＧ３′; b)　XSV５７３R１:５′ＧGGAＧGTCＧCCAＧATAＧTGTＧTACＧCAAＧAGＧ３′; c)　XSV２３６F２:５′ＧACAＧTTGＧRCGＧGTTＧGGGＧTCAＧTAＧ３′; d)　XSV２３６R２:５′ＧGTGＧCCTＧGTTＧGCTＧGAAＧATAＧCCＧ３′. ５􀆰１７　MrNV荧光定量PCR引物:引物浓度为１０μmol/L,－２０℃保存.扩增引物分别是MrNVＧ Tq１２９F和MrNVＧTq１２９R,扩增MrNVRNA１中的１２９bp片段(见A􀆰３);探针MrNVＧTqMAN.引物、 探针序列如下: a)　MrNVＧTq１２９F:５′ＧGACＧCCAＧAAAＧGTAＧGCGＧAAGＧGAＧ３′; b)　MrNVＧTq１２９R:５′ＧGGCＧYTCＧTCCＧCTTＧTAGＧTGTＧTＧ３′; c)　MrNVＧTqMAN:５′Ｇ６ＧFAMＧAAGＧCAAＧCCGＧCCTＧTCAＧATGＧCCＧBHQ１Ｇ３′. ５􀆰１８　XSV荧光定量PCR引物:引物浓度为１０μmol/L,－２０℃保存.其中,扩增引物分别是XSVＧ Tq１２８F和XSVＧTq１２８R,扩增XSV衣壳蛋白基因中的１２８bp片段(见A􀆰４);探针XSVＧTqMAN.引 物、探针序列如下: a)　XSVＧTq１２８F:５′ＧTCAＧTAGＧAGCＧCGCＧAGYＧAGGＧTAＧ３′; b)　XSVＧTq１２８R:５′ＧCCAＧARGＧCACＧGAAＧCCAＧCTGＧGAＧ３′; ２SC/T７２４２—２０２２ c)　XSVＧTqMAN:５′Ｇ６ＧFAMＧACGＧGTAＧTTTＧCAGＧCAAＧCAGＧGCAＧCACＧTCAＧBHQ１Ｇ３′. ５􀆰１９　阳性对照为确定感染MrNV和XSV的罗氏沼虾组织样品,－８０℃保存. ５􀆰２０　阴性对照为确定未感染MrNV和XSV的罗氏沼虾组织样品,－８０℃保存. ５􀆰２１　空白对照为水. ６　仪器和设备 ６􀆰１　PCR仪. ６􀆰２　荧光定量PCR仪. ６􀆰３　水平电泳仪. ６􀆰４　紫外观察仪或凝胶成像仪. ６􀆰５　高速冷冻离心机. ６􀆰６　水浴锅或金属浴. ６􀆰７　普通冰箱. ６􀆰８　－８０℃超低温冰箱. ６􀆰９　电炉或微波炉. ６􀆰１０　微量移液器. ７　临床症状 虾体不透明,尾部肌肉出现白浊现象,尤其在腹部.发病初期,第二或第三腹节出现肌肉白浊现 象,并逐渐向前后扩散.严重时,尾部肌肉整体发白.初次出现症状后,第５d死亡率达到高峰.特征 见附录B. ８　采样 ８􀆰１　对象 幼体、仔虾、稚虾和成虾,优先采集淡化后的仔虾. ８􀆰２　数量 应符合SC/T７１０