2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 鱼 类 病 毒 性 神 经 坏 死 病 诊 断 方 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 7 2 1 6 — 2 0 2 2 D i a g n o s t i c m e t h o d s f o r v i r a l n e r v o u s n e c r o s i s o f f i s h S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 S C / T 7 2 1 6 — 2 0 1 2SC/T７２１６—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替SC/T７２１６—２０１２«鱼类病毒性神经坏死病(VNN)诊断技术规程»,与SC/T７２１６—２０１２ 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　增加了“术语和定义”一章(见第３章); b)　增加了“临床症状”一章,描述了鱼类病毒性神经坏死病的典型症状(见第７章); c)　增加了“采样”一章,规范了采样对象、采样数量和采样部位(见第８章); d)　简化了对病理检查方法的描述(见第９章,２０１２年版的第６章); e)　增加了一种病毒分离用的GFＧ１细胞系(见１０􀆰２),增加了病毒分离结果的判定方法(见１０􀆰３); f)　删除了“免疫荧光”(见２０１２年版的８􀆰１)、“免疫组织化学”(见２０１２年版的８􀆰２)、“RTＧPCR方 法”(见２０１２年版的８􀆰３); g)　增加了“套式RTＧPCR检测”一章(见第１１章); h)　将“实时荧光RTＧPCR方法”更改为“RTＧqPCR检测”,提供了新的引物、探针、反应体系和反应 程序,修改了结果判定方法(见第１２章,２０１２年版的８􀆰４); i)　将“结果综合判定”更改为“综合判定”,更改了疑似病例、确诊病例的判定方法,增加了病毒携带 者的判定方法(见第１３章,２０１２年版的第９章); j)　删除了“病毒性神经坏死病临床症状和病理变化”(见２０１２年版的附录B),增加了“鱼类病毒性 神经坏死病(VNN)”(见附录B); k)　增加了鱼类病毒性神经坏死病组织病理特征示例(见附录C); l)　增加了鱼类神经坏死病毒扩增产物的参考序列(见附录D). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC１５６)归口. 本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、福建省淡水水产研 究所、福建省水产技术推广总站. 本文件主要起草人:史成银、万晓媛、樊海平、于秀娟、梁艳、吴斌、杨冰、刘莉、李清、林楠、李苗苗、张惠 芬、王仁宝、于子健. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２０１２年首次发布为SC/T７２１６—２０１２; ———本次为第一次修订. ⅠSC/T７２１６—２０２２ 鱼类病毒性神经坏死病诊断方法 １　范围 本文件界定了鱼类病毒性神经坏死病(viralnervousnecrosis,VNN)诊断的术语和定义,给出了缩略 语、试剂和材料、仪器和设备,描述了临床症状,规定了采样要求,以及组织病理检查、病毒分离、套式RTＧ PCR检测、RTＧqPCR检测和综合判定的方法. 本文件适用于鱼类病毒性神经坏死病的流行病学调查、诊断、检疫和监测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. SC/T７０１１􀆰１　水生动物疾病术语与命名规则　第１部分:水生动物疾病术语 SC/T７０１１􀆰２　水生动物疾病术语与命名规则　第２部分:水生动物疾病命名规则 SC/T７１０３　水生动物产地检疫采样技术规范 ３　术语和定义 SC/T７０１１􀆰１和SC/T７０１１􀆰２界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. AMV:禽成髓细胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus) BFNNV:条斑星鲽神经坏死病毒(barfinfloundernervousnecrosisvirus) BHQ１:淬灭剂(blackholequencher１) CPE:细胞病变效应(cytopathiceffect) Cq:定量循环(quantificationcycle) cDNA:互补DNA(complementaryDNA) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyＧribonucleosidetriphosphatemixture) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) EＧ１１:从纹鳢细胞系Ｇ１(SSNＧ１)中克隆得到的EＧ１１细胞系(EＧ１１cellline) FAM:羧基荧光素(carboxyfluorescein) GFＧ１:石斑鱼鳍细胞系(grouperfincellline,GFＧ１) NNV:神经坏死病毒(nervousnecrosisvirus) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) qPCR:实时荧光PCR(quantitativerealＧtimePCR) RGNNV:赤点石斑鱼神经坏死病毒(redspottedgroupernervousnecrosisvirus) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RTＧPCR:逆转录PCR(reversetranscriptionPCR) RTＧqPCR:实时荧光RTＧPCR(reversetranscriptionquantitativerealＧtimePCR) SJNNV:黄带拟鲹神经坏死病毒(stripedjacknervousnecrosisvirus) １SC/T７２１６—２０２２ SSNＧ１:纹鳢细胞系Ｇ１(stripedsnakeheadfishcellline,SSNＧ１) Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus) TPNNV:红鳍东方鲀神经坏死病毒(tigerpuffernervousnecrosisvirus) VNN:病毒性神经坏死病(viralnervousnecrosis) ５　试剂和材料 ５􀆰１　水:蒸馏水、去离子水或相当纯度的水;RNA提取和cDNA合成应使用DEPC处理水. ５􀆰２　７０％乙醇:按附录A中A􀆰１配制. ５􀆰３　７５％乙醇:按A􀆰２配制. ５􀆰４　异丙醇:分析纯. ５􀆰５　水饱和酚. ５􀆰６　氯仿/异戊醇:氯仿与异戊醇的体积比为４９∶１. ５􀆰７　Davidson′sAFA固定液:按A􀆰３配制. ５􀆰８　苏木精染色液:按A􀆰４配制. ５􀆰９　伊红染色液:按A􀆰５配制. ５􀆰１０　细胞系:SSNＧ１、EＧ１１或GFＧ１. ５􀆰１１　细胞培养液:按A􀆰６配制,或使用其他等效商品化试剂. ５􀆰１２　鱼类神经坏死病毒参考株:由动物防疫主管部门指定单位提供. ５􀆰１３　RNA提取变性液:按A􀆰７配制,或使用其他等效商品化试剂. ５􀆰１４　乙酸钠缓冲液:按A􀆰８配制. ５􀆰１５　AMV逆转录酶、TaqDNA聚合酶:－２０℃保存. ５􀆰１６　５×逆转录酶缓冲液、１０×TaqDNA聚合酶缓冲液:－２０℃保存. ５􀆰１７　RNA酶抑制剂:－２０℃保存. ５􀆰１８　dNTPs:含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各１０mmol/L的混合物,－２０℃保存. ５􀆰１９　琼脂糖:电泳级. ５􀆰２０　０􀆰５×TBE电泳缓冲液:按A􀆰９配制. ５􀆰２１　电泳核酸染料:溴化乙锭或其他等效试剂. ５􀆰２２　随机引物:－２０℃保存. ５􀆰２３　套式RTＧPCR引物:用于扩增NNV的衣壳蛋白基因片段.引物NNV１和引物NNV２是第一轮 PCR引物,目的产物大小约６１０bp;引物NNV３和引物NNV４是第二轮PCR引物,目的产物大小约 ２５５bp.序列如下: a)　引物NNV１:５′ＧACAＧCTGＧGAGＧTTTＧGAAＧATTＧCAＧ３′; b)　引物NNV２:５′ＧGTCＧTTGＧTTGＧAAGＧTTGＧTCCＧCAＧ３′; c)　引物NNV３:５′ＧATTＧGTGＧCCCＧCGCＧAAAＧCACＧ３′; d)　引物NNV４:５′ＧGACＧACGＧTTGＧACCＧACAＧTCAＧGTＧ３′. ５􀆰２４　RTＧqPCR引物和探针:用于检测NNV的衣壳蛋白基因片段,为简并引物和探针.序列如下: a)　引物RNA２FOR:５′ＧCAAＧCTGＧACAＧRCGＧAHCＧACAＧCＧ３′; b)　引物RNA２REV:５′ＧCCCＧACCＧAYTＧTGGＧCVAＧCＧ３′; c)　探针RNA２probe:５′Ｇ６FAMＧTYCＧARGＧCRAＧCTCＧGTGＧGTGＧCVGＧBHQ１Ｇ３′. ６　仪器和设备 ６􀆰１　光学显微镜. ２SC/T７２１６—２０２２ ６􀆰２　组织研磨器. ６􀆰３　高速冷冻离心机. ６􀆰４　生化培养箱.