2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 水 产 养 殖 动 物 细 菌 耐 药 性 调 查 规 范 通 则 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 7 0 2 8 — 2 0 2 2 S p e c i f i c a t i o n f o r m o n i t o r i n g o f a n t i m i c r o b i a l r e s i s t a n c e i n b a c t e r i a f r o m a q u a t i c a n i m a l s — G e n e r a l p r i n c i p l e S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T７０２８—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC１５６)归口. 本文件起草单位:全国水产技术推广总站、中国水产科学研究院珠江水产研究所. 本文件主要起草人:刘忠松、邓玉婷、陈艳、陈学洲、姜兰、冯东岳、宋晨光. ⅠSC/T７０２８—２０２２ 水产养殖动物细菌耐药性调查规范 １　范围 本文件界定了水产养殖动物细菌耐药性调查规范的术语和定义,确立了水产养殖动物细菌耐药性调 查流程,规定了细菌耐药性调查中样品采集、信息采集、细菌分离鉴定、菌株保存、药物敏感性试验、结果判 定和结果记录与统计的要求,描述了上述各步骤相应追溯或证实的方法. 本文件适用于水产养殖动物细菌对渔用抗菌药物的耐药性调查. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 SC/T７０１９　水生动物病原菌实验室保存规范 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 采样点　samplesite 同一水域、同一品种、相同环境及养殖条件的养殖场为一个采样点. ３􀆰２ 最小抑菌浓度　minimalinhibitoryconcentration,MIC 在采用稀释法测定药物敏感性的试验中,能抑制细菌生长的最低抗菌药物浓度. ３􀆰３ 折点　breakpoint 用于区分菌株为敏感、中介和耐药的MIC值. ３􀆰４ 敏感　susceptible 抗菌药物对菌株的MIC值等于或低于敏感折点,即菌株对该药物表现为敏感. ３􀆰５ 中介　intermediate 抗菌药物对菌株的MIC值在高于敏感折点且低于耐药折点的范围内,即菌株对该药物表现为中介. ３􀆰６ 耐药　resistant 抗菌药物对菌株的MIC值等于或高于耐药折点,即菌株对该药物表现为耐药. ４　耐药性调查流程 细菌耐药性调查按以下流程进行: a)　样品采集; b)　信息采集; c)　细菌分离鉴定; １SC/T７０２８—２０２２ d)　菌株保存; e)　药物敏感性试验(微量肉汤稀释法); f)　结果判定; g)　结果记录与统计. ５　耐药性调查的实施 ５􀆰１　样品采集 ５􀆰１􀆰１　采样对象 水产养殖动物,每尾(个)动物个体为一个样品. ５􀆰１􀆰２　采样频次 每个采样点每年至少３次,每次间隔２个月或以上. ５􀆰１􀆰３　采样数量 每个采样点每次采集不少于１０个样品,全年不少于３０个样品. ５􀆰１􀆰４　样品采集、保存及运输 样品采集后分别放置于清洁、干燥、密封的容器中,且存放温度为０℃~１０℃,应在１２h内进行细菌 分离.每个样品分别加贴采样标签,注明采样地、采样编号、采样人和采样日期. ５􀆰２　信息采集 采样人员记录养殖场基本信息和样品来源信息.按附录A的要求填写采样记录表. ５􀆰３　细菌分离鉴定 根据不同细菌分别选择适宜的培养基、培养条件和鉴定方法.对样品进行细菌分离培养,采用生理生 化反应和分子生物学等方法对分离菌株进行菌种鉴定.每个样品分离菌株１株~２株,每个采样点每年 分离菌株不少于３０株. ５􀆰４　菌株保存 分离的菌株若不能及时进行药物敏感性试验,应置于０℃~４℃冰箱中保存,时间不超过４８h;或按 照SC/T７０１９的规定,采用甘油保存法或真空冷冻干燥法,置于－２０℃或－８０℃冰箱中保存. ５􀆰５　药物敏感性试验 采用微量肉汤稀释法对分离菌株进行药物敏感性测定.具体操作方法和步骤按附录B的规定进行. ５􀆰６　结果判定 根据不同抗菌药物对受试菌的MIC值结果,将菌株判定为敏感、中介或耐药.不同细菌的耐药性判 定参考值见附录C. ５􀆰７　结果记录与统计 将每一受试菌的菌株编号、菌种名称、对各种药物的MIC结果以及判定结果记录于药物敏感性试验 结果记录表中,见附录D.按照公式(１)、公式(２)、公式(３)分别计算分离菌株的敏感率、中介率及耐药率. 敏感率＝(敏感菌株数/受试菌株总数)×１００％ (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 中介率＝(中介菌株数/受试菌株总数)×１００％ (２) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 耐药率＝(耐药菌株数/受试菌株总数)×１００％ (３) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２SC/T７０２８—２０２２ 附　录　A (规范性) 采样记录表 采集养殖场基本信息和样品来源信息等按表A􀆰１的要求填写. 表A􀆰１　采样记录表 一、养殖场基本信息 场名: 联系人: 电话: 地址: 主要养殖品种: 养殖面积:□≤１０亩　□１１亩~１００亩　□＞１００亩 养殖模式: 养殖年限:□１年~２年　□３年~５年　□５年以上 二、样品来源信息 动物品种: 样品数量: 样品规格:平均体重　　　;平均体长 采样部位: 发病情况: 使用抗菌药物情况: 其他情况(疑似病因判定): 采样人(签名): 采样时间:年月日 ３SC/T７０２８—２０２２ 附　录　B (规范性) 药物敏感性试验(微量肉汤稀释法) B􀆰１　试剂和材料 B􀆰１􀆰１　抗菌药物 B􀆰１􀆰１􀆰１　标准品 氟苯尼考、盐酸多西环素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲 唑、甲氧苄啶和恩诺沙星等. B􀆰１􀆰１􀆰２　抗菌药物储备液的制备 B􀆰１􀆰１􀆰２􀆰１　抗菌药物粉剂的称量 抗菌药物粉剂应在分析天平上称量,并且根据公式(B􀆰１)计算制备储备液的粉剂剂量. 重量(mg)＝浓度(μg/mL)×容量(mL)÷含量(％)×０􀆰００１ (B􀆰１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 B􀆰１􀆰１􀆰２􀆰２　溶剂与稀释剂 各药物的溶剂与稀释剂见表B􀆰１.试验用水应符合GB/T６６８２中三级水的要求. 表B􀆰１　抗菌药物储备液所用的溶剂和稀释剂 药物名称储备液浓度 μg/mL溶剂 稀释剂 氟苯尼考 ３２０ ９５％乙醇 水 磺胺间甲氧嘧啶 ２０４８０ １/２体积的水和最小浓度为２􀆰５mol/LNaOH至溶解c水 磺胺甲 唑a１２１６０ １/２体积的水和最小浓度为２􀆰５mol/LNaOH至溶解c水 甲氧苄啶a６４０ ０􀆰０５mol/L乳酸或盐酸,终体积的１０％ 水c 恩诺沙星b８０ １/２体积的水,后逐滴加入１mol/LNaOH至最终溶解 水 盐酸多西环素 １６０ 水 水 　　a　复方药物,先单独配制与储存,做药物敏感性试验时,再按１∶１等体积混合使用. b　恩诺沙星为盐类时,溶剂为水. c　药物如有析出,稍微温热使其溶解. B􀆰１􀆰１􀆰２􀆰３　溶剂与稀释剂 将称取的抗菌药物溶解于无菌水或溶剂中,应使用容量瓶定容,并采用０􀆰２２μm微孔滤膜过滤除菌. 制备完的药液,置于４℃冰箱中保存,４周内使用. B􀆰１􀆰２　水解酪蛋白(MuellerＧHinton,MH)肉汤培养基 按产品说明用干粉培养基配制MH肉汤,试验用水应符合GB/T６６８２中三级水的要求.针对需要 复杂营养的细菌,应在MH肉汤里添加适宜其生长的物质. B􀆰１􀆰３　质控菌株 大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC２５９２２. B􀆰１􀆰４　９６孔板 宜选用规格１０􀆰７mm×１０􀆰０mm×１６􀆰９mm、聚苯乙烯材质、U型孔底、带盖、每孔可容纳５００μL液 体的无菌９６孔板. B􀆰２　仪器设备 恒温培养箱、恒温摇床、高压灭菌锅、分析天平、电热鼓风干燥箱、冰箱、移液器、超净工作台等. B􀆰３　抗菌药物稀释 取灭菌MH肉汤,在无菌９６孔板的第１孔加入１６０μL,在第２孔至第１０孔中分别加入１００μL.在 第１孔中加入抗菌药储备液４０μL,吹打混匀;取第１孔中的含药肉汤１００μL至第２孔中吹打混匀;吸取 ４