2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 海 藻 及 其 制 品 中 L - 岩 藻 糖 的 测 定 液 相 色 谱 法 2 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 1 2 0 . 3 0 C C S X 3 0 6 4 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f L - f u c o s e i n s e a w e e d a n d i t s p r o d u c t s — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T３０６４—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会(SAC/TC１５６/SC３)归口. 本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、青岛明月海藻集团有限公司、青岛海之林生 物科技开发有限公司、日照健安检测技术服务有限公司、山东海之宝海洋科技有限公司、山东省海洋资源 与环境研究院. 本文件主要起草人:孙伟红、郭莹莹、孙占一、陈宏、王联珠、郭晓华、申培丽、刘晓勇、徐英江、刘兴勇、 李文刚、朱文嘉、邢丽红、孙晓杰、冷凯良、苗钧魁、彭吉星. 本文件为首次发布. ⅠSC/T３０６４—２０２５ 　 　 　海藻及其制品中LＧ岩藻糖的测定液相色谱法 １　范围 本文件描述了用液相色谱法测定海藻及其制品中LＧ岩藻糖含量的原理、试剂和材料、仪器设备、样品 的制备与保存、测定步骤、数据处理、方法灵敏度和精密度. 本文件适用于鲜海藻、盐渍海藻、干海藻及岩藻多糖中LＧ岩藻糖含量的测定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T３０８９１—２０１４　水产品抽样规范 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中岩藻多糖在酸性条件下水解为LＧ岩藻糖,经１Ｇ苯基Ｇ３Ｇ甲基Ｇ５Ｇ吡唑啉酮衍生化,液相色谱紫外 检测器或二极管阵列检测器测定,外标法定量. ５　试剂和材料 除另有说明,所有试剂均为分析纯,试验用水应符合GB/T６６８２一级水的规定. ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　甲醇(CH３OH):色谱纯. ５􀆰１􀆰２　三氯甲烷(CHCl３). ５􀆰１􀆰３　乙腈(CH３CN):色谱纯. ５􀆰１􀆰４　硫酸(H２SO４):含量９５％~９８％. ５􀆰１􀆰５　氨水(NH３􀅰H２O):含量２５％~２８％. ５􀆰１􀆰６　磷酸二氢钾(KH２PO４). ５􀆰１􀆰７　氢氧化钠(NaOH). ５􀆰１􀆰８　１Ｇ苯基Ｇ３Ｇ甲基Ｇ５Ｇ吡唑啉酮(C１０H１０N２O,PMP,CAS号:８９Ｇ２５Ｇ８):化学纯,纯度≥９９􀆰０％. ５􀆰１􀆰９　冰乙酸(C２H４O２). ５􀆰１􀆰１０　磷酸(H３PO４):含量≥８５％. ５􀆰２　标准品 ５􀆰２􀆰１　LＧ岩藻糖标准品(C６H１２O５,CAS号:２４３８Ｇ８０Ｇ４),纯度≥９８􀆰０％. ５􀆰３　溶液配制 ５􀆰３􀆰１　１mol/L硫酸溶液:移取硫酸５􀆰４mL,缓缓注入适量水中,冷却至室温后用水定容至１００mL, 混匀. ５􀆰３􀆰２　０􀆰１mol/L磷酸二氢钾缓冲液:称取磷酸二氢钾６􀆰８０g,加入约４００mL水溶解,用氨水调节pH １SC/T３０６４—２０２５ 为６􀆰８~７􀆰０,再用水定容至５００mL,混匀. ５􀆰３􀆰３　１mol/L氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠４􀆰００g,用适量水溶解,冷却至室温后用水定容至１００mL, 混匀. ５􀆰３􀆰４　０􀆰３mol/L氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠１􀆰２０g,用适量水溶解,冷却至室温后用水定容至 １００mL,混匀. ５􀆰３􀆰５　０􀆰５mol/LPMPＧ甲醇溶液:称取４􀆰３６gPMP,用甲醇溶解并定容至５０mL,现用现配. ５􀆰３􀆰６　０􀆰３mol/L冰乙酸溶液:移取冰乙酸１􀆰７mL,用水定容至１００mL,混匀. ５􀆰３􀆰７　５０mmol/L磷酸溶液:移取磷酸３３３μL,用水定容至１００mL,混匀. ５􀆰３􀆰８　５０mmol/L磷酸二氢钾缓冲液:称取磷酸二氢钾６􀆰８０g,加入约９００mL水溶解,用氨水调节pH 为６􀆰８~７􀆰０,再用水定容至１L,过０􀆰４５μm滤膜,备用. ５􀆰４　标准溶液配制 ５􀆰４􀆰１　LＧ岩藻糖标准储备液(１􀆰０mg/mL):称取LＧ岩藻糖标准品约１０mg(精确至０􀆰０１mg),用水溶解 并定容于１０mL容量瓶中,４℃密封保存,有效期１５d. ５􀆰４􀆰２　LＧ岩藻糖标准中间液(１００μg/mL):准确量取LＧ岩藻糖标准储备液(５􀆰４􀆰１)适量,用水稀释配制成 浓度为１００μg/mL的LＧ岩藻糖标准中间液,现配现用. ５􀆰５　材料 ５􀆰５􀆰１　具塞消化管:２０mL螺旋盖玻璃试管,配置聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBTP)耐压盖. ５􀆰５􀆰２　精密pH试纸:测量范围４􀆰５~９􀆰０和０􀆰０~６􀆰０. ５􀆰５􀆰３　具塞试管:１０mL,聚丙烯材质. ５􀆰５􀆰４　针式滤器:水相,０􀆰２２μm. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱仪:配紫外检测器或二极管阵列检测器. ６􀆰２　分析天平:感量分别为０􀆰０１g、０􀆰１mg和０􀆰０１mg. ６􀆰３　涡旋混合器. ６􀆰４　电热恒温鼓风干燥箱. ６􀆰５　离心机:转速不低于４０００r/min. ６􀆰６　恒温水浴锅. ７　样品的制备与保存 ７􀆰１　试样制备 湿基试样制备按GB/T３０８９１—２０１４附录B的规定执行;干制品试样粉碎后全部过０􀆰４２５mm孔径 分析筛,充分混匀后装入洁净容器中密封备用. ７􀆰２　试样的保存 鲜海藻、盐渍海藻置于－１８℃以下保存,干海藻和岩藻多糖试样置于常温干燥环境下保存. ８　测定步骤 ８􀆰１　水解 ８􀆰１􀆰１　鲜海藻、盐渍海藻 称取试样１g~２g(精确至０􀆰０１g)于２０mL具塞消化管中,加入１mol/L硫酸溶液(５􀆰３􀆰１)５mL,充 分涡旋,充氮封管,置于电热恒温干燥箱中,１１０℃水解２h.取出消化管冷却至室温,将水解液全部转移 至５０mL离心管中,用０􀆰１mol/L磷酸二氢钾缓冲液(５􀆰３􀆰２)５mL分２次冲洗消化管,冲洗液合并于上 ２SC/T３０６４—２０２５ 述５０mL离心管中.４０００r/min离心５min,将上清液转移至２５mL容量瓶中,加入１mol/L氢氧化钠 溶液(５􀆰３􀆰３)８􀆰０mL~８􀆰４mL,将pH调节至４􀆰５~９􀆰０,加０􀆰１mol/L磷酸二氢钾缓冲液(５􀆰３􀆰２)定容至 刻度.上述水解液若不能及时衍生化应密封保存,放置时间不应超过２４h. ８􀆰１􀆰２　干海藻、岩藻多糖 称取干海藻试样０􀆰１g(精确至０􀆰１mg)或岩藻多糖试样０􀆰０２g(精确至０􀆰１mg)于２０mL具塞消化 管中,加入１mol/L硫酸溶液(５􀆰３􀆰１)２mL,充分涡旋,充氮封管,置于电热恒温干燥箱中,１１０℃水解２h. 取出消化管冷却至室温,将水解液全部转移至５０mL离心管中,用０􀆰１mol/L磷酸二氢钾缓冲液(５􀆰３􀆰２) ５mL分２次冲洗消化管,洗液并于上述５０mL离心管中.４０００r/min离心１０min,将上清液转移到 ２５mL容量瓶中,加入１mol/L氢氧化钠溶液(５􀆰３􀆰３)３􀆰７mL~４􀆰０mL,将pH调节至４􀆰５~９􀆰０,加 ０􀆰１mol/L磷酸二氢钾缓冲液(５􀆰３􀆰２)定容至刻度.上述水解液若不能及时衍生化应密封保存,放置时间 不应超过２４h. ８􀆰２　衍生化 ８􀆰２􀆰１　准确移取８􀆰１制备的水解液１mL于具塞试管中,准确加入０􀆰３mol/L氢氧化钠溶液(５􀆰３􀆰４) １mL、０􀆰５mol/LPMPＧ甲醇溶液(５􀆰３􀆰５)１mL,涡旋混合３０s,置于恒温水浴锅中,７０℃反应７０min.取 出冷却至室温,准确加入０􀆰３mol/L冰乙酸溶液(５􀆰３􀆰６)１mL、水１mL,涡旋混匀. ８􀆰２􀆰２　准确移取上述试液１mL于另一具塞试管中,加入三氯甲烷(５􀆰１􀆰２)２mL,涡旋混合３０s,静置分 层,吸弃下层三氯甲烷相,按上述方法再用三氯甲烷重复萃取２次.准确移取上层水相５００μL,准确加入 ５０mmol/L磷酸溶液(５􀆰３􀆰７)５００μL,涡旋混匀,此时pH应为４􀆰０~４􀆰５,用针式滤器过滤至进样小瓶中, 供液相色谱分析. ８􀆰３　标准工作曲线制作 准确移取适量１􀆰０mg/mLLＧ岩藻糖标准储备液(５􀆰４􀆰１)或者１００μg/mLLＧ岩藻糖标准中间液 (５􀆰４􀆰２),用水配制成LＧ岩藻糖浓度分别为１０μg/mL、２０μg/mL、５０μg/mL、１００μg/mL、２００μg/mL、 ５００μg/mL的系列标准工作液,按照８􀆰２的步骤进行衍生化,供液相色谱测定.以LＧ岩藻糖衍生物的峰 面积为纵坐标,相应的LＧ岩藻糖浓度为横坐标绘制标准曲线.LＧ岩藻糖衍生物标准液相色谱图见附录A 中的图A􀆰１. ８􀆰４　测定 ８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:C１８色谱柱,２５０mm×４􀆰６mm(i􀆰d􀆰),