2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 生 金 枪 鱼 肉 种 类 鉴 定 方 法 实 时 荧 光 P C R 法 2 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 0 5 0 C C S X 3 0 6 2 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f r a w t u n a m e a t s p e c i e s — R e a l - t i m e P C R m e t h o d S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T３０６２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会(SAC/TC１５６/SC３)归口. 本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、国家水产品质量检验检测中心. 本文件主要起草人:姚琳、王联珠、曲梦、江艳华、朱文嘉、郭莹莹、柳淑芳、李娜、谭志军、宁劲松、王小娟. 本文件为首次发布. ⅠSC/T３０６２—２０２５ 　 　 　生金枪鱼肉种类鉴定方法实时荧光PCR法 １　范围 本文件描述了用实时荧光PCR法测定生金枪鱼肉种类的原理、试剂和材料、仪器设备、样品制备、 DNA提取、DNA纯度和浓度测定、测定方法、质量控制与结果判定、防污染措施. 本文件适用于生金枪鱼肉产品种类的定性检测.包括马苏金枪鱼(Thunnusmaccoyii)、大目金枪鱼 (Thunnusobesus)、长鳍金枪鱼(Thunnusalalunga)、蓝鳍金枪鱼(Thunnusthynnus)、黄鳍金枪鱼 (Thunnusalbacares)的生鱼肉产品.本文件不适用于混合样品. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T１９４９５􀆰４　转基因产品检测　实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR)检测方法 GB/T２７４０３　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 ３　术语和定义 GB/T１９４９５􀆰４界定的下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 实时荧光　PCRrealＧtimepolymerasechainreaction 实时荧光聚合酶链式反应.在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程,并通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法. ３􀆰２ Ct值　cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. BSA:牛血清蛋白(bullserumalbumin) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide) Ct:循环阈值(cyclethreshold) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid) DNase:脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease) dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate) dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate) dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate) dNTPs:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate) dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) FAM:羧基荧光素(carboxyfluorescein) IU:酶活国际单位(InternationalUnit) １SC/T３０６２—２０２５ MGB:小沟结合物(minorgroovebinder) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RNaseH:核糖核酸酶H(ribonucleaseH) ROX:羧基ＧXＧ罗丹明(carboxyＧXＧrhodamine) SNP:单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism) Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticu) Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] TrisＧbase:(三(羟甲基)氨基甲烷碱) TritonXＧ１００:(聚乙二醇辛基苯基醚) １８SrRNA:１８S核糖体RNA(１８SribosomalRNA) ５　原理 针对金枪鱼物种特异性SNP位点设计引物与探针,通过分析实时荧光PCR扩增曲线与Ct值,对生 金枪鱼肉的种类进行定性判定. ６　试剂和材料 除另有规定外,所用试剂均为分析纯或生化试剂;实验用水为GB/T６６８２中规定的一级水;所用试 剂、材料均应不含DNA和DNase. ６􀆰１　试剂 ６􀆰１􀆰１　苯酚. ６􀆰１􀆰２　浓盐酸. ６􀆰１􀆰３　氯仿. ６􀆰１􀆰４　异戊醇. ６􀆰１􀆰５　异丙醇. ６􀆰１􀆰６　无水乙醇. ６􀆰１􀆰７　CTAB. ６􀆰１􀆰８　氯化钠. ６􀆰１􀆰９　TrisＧbase. ６􀆰１􀆰１０　Na２EDTA. ６􀆰１􀆰１１　蛋白酶K:４０IU/mg. ６􀆰１􀆰１２　热启动TaqDNA聚合酶:５IU/μL. ６􀆰１􀆰１３　RNaseH:５IU/μL. ６􀆰１􀆰１４　氯化钾. ６􀆰１􀆰１５　硫酸铵. ６􀆰１􀆰１６　七水硫酸镁. ６􀆰１􀆰１７　TritonXＧ１００. ６􀆰１􀆰１８　BSA. ６􀆰１􀆰１９　dNTPs. ６􀆰１􀆰２０　dATP. ６􀆰１􀆰２１　dCTP. ６􀆰１􀆰２２　dGTP. ６􀆰１􀆰２３　dTTP. ２SC/T３０６２—２０２５ ６􀆰１􀆰２４　ROX. ６􀆰１􀆰２５　引物与探针的名称及序列按附录A. ６􀆰２　溶液配制 ６􀆰２􀆰１　苯酚:氯仿:异戊醇混合液:取２５mL苯酚(６􀆰１􀆰１)、２４mL氯仿(６􀆰１􀆰３)与１mL异戊醇(６􀆰１􀆰４)混 匀,静置１２h. ６􀆰２􀆰２　TritonXＧ１００溶液:取１００μLTritonXＧ１００(６􀆰１􀆰１７)与９􀆰９mL水混匀. ６􀆰２􀆰３　２０mg/mLBSA溶液:取０􀆰２gBSA(６􀆰１􀆰１８)用水溶解并定容至１０mL. ６􀆰２􀆰４　７０％乙醇:取７０mL无水乙醇(６􀆰１􀆰６)与３０mL水混匀. ６􀆰２􀆰５　CTAB裂解液:用８００mL水溶解２０􀆰０gCTAB(６􀆰１􀆰７),８１􀆰８g氯化钠(６􀆰１􀆰８),１２􀆰１gTrisＧbase (６􀆰１􀆰９),７􀆰５gNa２EDTA(６􀆰１􀆰１０),调节pH值至８􀆰０,用水定容至１L,分装后高温高压灭菌. ６􀆰２􀆰６　CTAB沉淀液:用８００mL水溶解５􀆰０gCTAB(６􀆰１􀆰７),２􀆰３４g氯化钠(６􀆰１􀆰８),用水定容至１L, 分装后高温高压灭菌. ６􀆰２􀆰７　２０mg/mL蛋白酶K溶液:用４mL水溶解０􀆰１g蛋白酶K(６􀆰１􀆰１１),用水定容至５mL,分装后保 存于－１８℃,避免反复冻融. ６􀆰２􀆰８　１􀆰２mol/L氯化钠溶液:用８０mL水溶解７􀆰０２g氯化钠(６􀆰１􀆰８),用水定容至１００mL,高温高压 灭菌. ６􀆰２􀆰９　实时荧光PCR反应预混液A(２×):１２􀆰５μL反应预混液内含１U的Taq酶、２２􀆰４mmol/L氯化 钾,３２mmol//L硫酸铵,３􀆰５mmol/L硫酸镁,３５mmol/LTrisＧHCl(pH８􀆰８),０􀆰１％TritonXＧ１００, ０􀆰２mg/mLBSA,０􀆰２mmol/LdNTPs混合液(含等量的dATP、dTTP、dCTP、dGTP).部分实时荧光 PCR仪需ROX校正,可按仪器生产厂家要求在反应预混液中添加.也可采用经验证可靠的实时荧光 PCR商业化试剂盒(探针法),具体参照说明书使用. ６􀆰２􀆰１０　实时荧光PCR反应预混液B(２×):１２􀆰５μL反应预混液内含１U的热启动Taq酶,２􀆰５U的 RNaseH,２５􀆰６mmol/L氯化钾,３８mmol//L硫酸铵,５mmol/L硫酸镁,５１mmol/LTrisＧHCl(pH８􀆰８), ０􀆰２mmol/L的dNTPs混合液(含等量的dATP、dTTP、dCTP、dGTP).部分实时荧光PCR仪需ROX 校正,可按仪器生产厂家要求在反应预混液中添加.也可采用经验证可靠的实时荧光PCR商业化试剂盒 (Cycling探针法),具体参照说明书使用. ７　仪器设备 ７􀆰１　实时荧光PCR仪. ７􀆰２　离心机:转速不小于１２０００r/min. ７􀆰３　核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计:配０􀆰５mL或１mL石英比色皿. ７􀆰４　天平:感量分别为０􀆰１g和０􀆰００１g. ７􀆰５　恒温水浴锅. ７􀆰６　高压灭菌锅. ７􀆰７　涡旋振荡器. ７􀆰８　微量移液器:０􀆰１μL~２􀆰５μL,０􀆰５μL~１０μL,２μL~２０μL,２０μL~２００μL,１００μL~１０００μ