2 0 2 3 0 4 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 8 0 1 － － 实 施 鳕 鱼 品 种 的 鉴 定 实 时 荧 光 P C R 法 2 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 1 2 0 . 3 0 C C S X 3 0 6 0 — 2 0 2 3 I d e n t i f i c a t i o n o f c o d f i s h s p e c i e s — R e a l - t i m e P C R m e t h o d S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T３０６０—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会(SAC/TC１５６/SC３)归口. 本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、日照健安检测技术服务有限公司、荣成泰祥 食品股份有限公司、山东时进检测服务有限公司. 本文件主要起草人:姚琳、王联珠、曲梦、江艳华、郭莹莹、朱文嘉、柳淑芳、谭志军、张廷翠、杨青、李娜、 蒋昕、毕迎斌. ⅠSC/T３０６０—２０２３ 鳕鱼品种的鉴定　实时荧光PCR法 １　范围 本文件描述了以实时荧光PCR法测定鳕鱼源性成分的原理、仪器设备、试剂和材料、样品制备、DNA 提取、DNA纯度和浓度测定、测定方法、结果判定与表达、防污染措施. 本文件适用于鳕鱼及易混鱼产品的定性检测.包括太平洋鳕鱼(Gadusmacrocephalus)、大西洋鳕鱼 (Gadusmorhua)、黑线鳕(Melanogrammusaeglefinu)、绿青鳕(Pollachiusvirens)、蓝鳕(Micromesistius poutassou)、细鳞壮鳕(Albatrossiapectoralis)、狭鳕(Theragrachalcogramma)、阿根廷无须鳕(MerlucＧ ciushubbsi)等鳕鱼,以及棘鳞蛇鲭(Ruvettuspretiosus)、异鳞蛇鲭(Lepidocybiumflavobrunneum)、小鳞 南极犬牙鱼(Dissostichuseleginoides)、莫氏南极犬牙鱼(Dissostichusmawsoni)、裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)等鳕鱼易混品种.本文件不适用于混合样品. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T１９４９５􀆰４　转基因产品检测　实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR)检测方法 GB/T２７４０３　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 ３　术语和定义 GB/T１９４９５􀆰４界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. BSA:牛血清蛋白(bullserumalbumin) COⅠ:细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(cytochromeoxidasesubunitⅠ) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide) Ct:循环阈值(cyclethreshold) Cytb:细胞色素b(cytochromeb) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid) DNase:脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease) dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate) dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate) dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate) dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate) dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) FAM:羧基荧光素(carboxyfluorescein) IU:酶活国际单位(internationalunit) MGB:小沟结合物(minorgroovebinder) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) １SC/T３０６０—２０２３ ROX:羧基ＧXＧ罗丹明(carboxyＧXＧrhodamine) SNP:单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism) Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticu) Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] １６SrRNA:１６S核糖体RNA(１６SribosomalRNA) １８SrRNA:１８S核糖体RNA(１８SribosomalRNA) ５　鳕鱼及其易混品种 ５􀆰１　鳕鱼 本文件中指鳕形目(Gadiformes)鱼类,主要指商业化捕捞、加工与贸易中常见的鳕科(Gadidae)、长尾 鳕科(Macrouridae)、无须鳕科(Merlucciidae)的主要品种. ５􀆰２　油鱼 本文件中指鲈形目带科棘鳞蛇鲭属的棘鳞蛇鲭(Ruvettuspretiosus)及异鳞蛇鲭属的异鳞蛇鲭 (Lepidocybiumflavobrunneum).切片后商品形态与鳕鱼类似,市场俗称油鱼. ５􀆰３　银鳕鱼 本文件中指商业化捕捞、加工与贸易中常见的鲈形目南极鱼科犬牙南极鱼属的小鳞南极犬牙鱼(DisＧ sostichuseleginoides)、莫氏南极犬牙鱼(Dissostichusmawsoni),鲉形目黑鲉科裸盖鱼属的裸盖鱼(AnoＧ plopomafimbria),市场俗称银鳕鱼.裸盖鱼也俗称黑鳕鱼. ６　原理 针对鳕鱼及其易混品种的特异性基因片段设计引物与探针,通过分析实时荧光PCR扩增曲线与Ct 值,对鳕鱼及其易混品种进行定性判定. ７　仪器设备 ７􀆰１　实时荧光PCR仪. ７􀆰２　离心机:转速不小于１２０００r/min. ７􀆰３　核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计. ７􀆰４　天平:感量０􀆰００１g. ７􀆰５　恒温水浴锅. ７􀆰６　高压灭菌锅. ７􀆰７　涡旋振荡器. ７􀆰８　微量移液器. ８　试剂和材料 除另有规定外,所用试剂均为分析纯;实验用水为GB/T６６８２中规定的一级水;所用试剂、材料均应 不含DNA和DNase. ８􀆰１　试剂 ８􀆰１􀆰１　苯酚. ８􀆰１􀆰２　浓盐酸. ８􀆰１􀆰３　氯仿. ８􀆰１􀆰４　异戊醇. ８􀆰１􀆰５　异丙醇. ８􀆰１􀆰６　无水乙醇. ２SC/T３０６０—２０２３ ８􀆰１􀆰７　CTAB. ８􀆰１􀆰８　氯化钠. ８􀆰１􀆰９　TrisＧbase. ８􀆰１􀆰１０　Na２EDTA. ８􀆰１􀆰１１　蛋白酶K:４０IU/mg. ８􀆰１􀆰１２　热启动TaqDNA聚合酶:５IU/μL. ８􀆰１􀆰１３　氯化钾. ８􀆰１􀆰１４　硫酸铵. ８􀆰１􀆰１５　七水硫酸镁. ８􀆰１􀆰１６　TritonXＧ１００. ８􀆰１􀆰１７　BSA. ８􀆰１􀆰１８　dNTP. ８􀆰１􀆰１９　dATP. ８􀆰１􀆰２０　dCTP. ８􀆰１􀆰２１　dGTP. ８􀆰１􀆰２２　dTTP. ８􀆰１􀆰２３　ROX. ８􀆰２　溶液 ８􀆰２􀆰１　２００􀆰０mmol/L氯化钾溶液:用８０mL水溶解１􀆰４９g氯化钾(８􀆰１􀆰１３)并定容至１００mL,高压 灭菌. ８􀆰２􀆰２　２００􀆰０mmol/L硫酸铵溶液:用８０mL水溶解２􀆰６４g硫酸铵(８􀆰１􀆰１４)并定容至１００mL. ８􀆰２􀆰３　２００􀆰０mmol/L硫酸镁溶液:用８０mL水溶解４􀆰９３g七水硫酸镁(８􀆰１􀆰１５)并定容至１００mL,高 压灭菌. ８􀆰２􀆰４　２００􀆰０mmol/LTrisＧHCl溶液:用８０mL水溶解１２􀆰１１gTrisＧbase(８􀆰１􀆰９),用浓盐酸(８􀆰１􀆰２)调 pH至８􀆰８,用水定容至１００mL,高压灭菌. ８􀆰２􀆰５　２􀆰０mmol/LdATP溶液:取０􀆰０１gdATP(８􀆰１􀆰１９),用水溶解并定容至１０mL. ８􀆰２􀆰６　２􀆰０mmol/LdCTP溶液:取０􀆰０１gdCTP(８􀆰１􀆰２０),用水溶解并定容至１０mL. ８􀆰２􀆰７　２􀆰０mmol/LdGTP溶液:取０􀆰０１gdGTP(８􀆰１􀆰２１),用水溶解并定容至１０mL. ８􀆰２􀆰８　２􀆰０mmol/LdTTP溶液:取０􀆰０１gdTTP(８􀆰１􀆰２２),用水溶解并定容至１０mL. ８􀆰２􀆰９　２􀆰０mmol/LdNTP溶液:取２􀆰５mL２􀆰０mmol/LdATP溶液(８􀆰２􀆰５)、２􀆰５mL２􀆰０mmol/L dCTP溶液(８􀆰２􀆰６)、２􀆰５mL２􀆰０mmol/LdGTP溶液(８􀆰２􀆰７)与２􀆰５mL２􀆰０mmol/LdTTP溶液 (８􀆰２􀆰８)混匀. ８􀆰２􀆰１０　７０％乙醇:量取７０mL无水乙醇(８􀆰１􀆰６)与３０mL水混匀. ８􀆰２􀆰１１　苯酚∶氯仿∶异戊醇混合液:量取２５mL苯酚(８􀆰１􀆰１)、２４mL氯仿(８􀆰１􀆰３)与１mL异戊醇 (８􀆰１􀆰４)