2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 水 产 品 及 其 制 品 中 磷 脂 含 量 的 测 定 液 相 色 谱 法 2 0 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 0 5 0 C C S X 3 0 5 7 — 2 0 2 2 D e t e r m i n a t i o n o f p h o s p h a t i d e i n f i s h a n d f i s h e r y p r o d u c t s — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T３０５７—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会(SAC/TC１５６/SC３)归口. 本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、国家水产品质量检验检测中心、中国水产科 学研究院黑龙江水产研究所. 本文件主要起草人:王联珠、彭吉星、孙言春、谭志军、郭莹莹、赵新楠、朱文嘉、文艺晓、吴海燕、郭萌 萌、郑关超. ⅠSC/T３０５７—２０２２ 水产品及其制品中磷脂含量的测定　液相色谱法 １　范围 本文件描述了用液相色谱法测定水产品及其制品中磷脂含量的原理、试剂和材料、仪器和设备、试样 制备与保存、测定步骤、结果计算、方法灵敏度和精密度. 本文件适用于鱼、贝、虾等水产品及其制品中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、溶血磷 脂酰胆碱５种磷脂含量的测定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T１５６８７　动植物油脂　试样的制备 GB/T３０８９１—２０１４　水产品抽样规范 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中磷脂经氯仿Ｇ甲醇溶液提取,固相萃取柱净化,液相色谱Ｇ蒸发光散射检测器检测,外标法定量. ５　试剂和材料 警示Ｇ应当严格遵循有毒物质的使用规程.采取有效措施保证组织和个人安全. 除另有说明,所有试剂均为色谱纯,试验用水应符合GB/T６６８２一级水的规定. ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　正己烷(C６H１４). ５􀆰１􀆰２　异丙醇(C３H８O). ５􀆰１􀆰３　氯仿(CHCl３). ５􀆰１􀆰４　甲醇(CH３OH). ５􀆰１􀆰５　乙酸(CH３COOH). ５􀆰１􀆰６　乙醚(C４H１０O). ５􀆰１􀆰７　三乙胺(C６H１５N). ５􀆰１􀆰８　盐酸(HCl):优级纯. ５􀆰１􀆰９　氯化钠(NaCl):优级纯. ５􀆰１􀆰１０　无水硫酸钠(Na２SO４):优级纯,１２０℃烘干４h,干燥器内冷却至室温,贮于密封瓶中备用. ５􀆰１􀆰１１　正己烷Ｇ异丙醇溶液(２＋３):量取４０mL正己烷和６０mL异丙醇,混匀. ５􀆰１􀆰１２　氯仿Ｇ甲醇溶液(９＋１):量取９mL氯仿和１mL甲醇,混匀. ５􀆰１􀆰１３　氯仿Ｇ甲醇溶液(２＋１):量取２００mL氯仿和１００mL甲醇,混匀. ５􀆰１􀆰１４　０􀆰９％氯化钠溶液:称取９g氯化钠,加１０００mL水溶解. １SC/T３０５７—２０２２ ５􀆰１􀆰１５　氯仿Ｇ异丙醇溶液(２＋１):量取２００mL氯仿和１００mL异丙醇,混匀. ５􀆰１􀆰１６　乙酸Ｇ乙醚溶液(１＋７２):量取４mL乙酸和２８８mL乙醚,混匀. ５􀆰１􀆰１７　２％盐酸溶液:量取５􀆰４mL盐酸,加水定容至１００mL,混匀. ５􀆰１􀆰１８　氯仿Ｇ甲醇Ｇ盐酸溶液(２００＋１００＋１):取２００mL氯仿和１００mL甲醇,加入１mL２％盐酸溶液, 混匀. ５􀆰１􀆰１９　０􀆰０４％三乙胺正己烷溶液:准确量取０􀆰４mL三乙胺,加正己烷定容至１０００mL,混匀. ５􀆰１􀆰２０　１３％乙酸溶液:准确量取１３０mL乙酸,加水定容至１０００mL,混匀. ５􀆰２　标准品 宜选择动物性来源标准品,５种磷脂标准品详细信息见附录A. ５􀆰３　标准溶液配制 ５􀆰３􀆰１　单一标准储备液 分别准确称取各磷脂标准品适量(精确至０􀆰１mg),其中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂和溶血磷 脂酰胆碱用正己烷Ｇ异丙醇溶液(５􀆰１􀆰１１)溶解,磷脂酰肌醇先用０􀆰５mL氯仿Ｇ甲醇溶液(５􀆰１􀆰１２)溶解后再 加入正己烷Ｇ异丙醇溶液(５􀆰１􀆰１１)稀释并定容,配制成质量浓度分别为磷脂酰乙醇胺１０００mg/L、磷脂酰 肌醇１０００mg/L、磷脂酰胆碱３０００mg/L、鞘磷脂１０００mg/L和溶血磷脂酰胆碱２０００mg/L的单一标 准储备液,于－１８℃下避光密封保存,有效期为１个月. ５􀆰３􀆰２　混合标准中间液 分别准确移取１􀆰８mL各磷脂单一标准储备液于同一１０mL棕色容量瓶中,用正己烷－异丙醇溶液 (５􀆰１􀆰１１)稀释并定容,配制成质量浓度分别为磷脂酰乙醇胺１８０mg/L、磷脂酰肌醇１８０mg/L、磷脂酰胆 碱５４０mg/L、鞘磷脂１８０mg/L和溶血磷脂酰胆碱３６０mg/L的混合标准中间液,现用现配. ５􀆰３􀆰３　系列混合标准工作溶液 分别准确移取适量混合标准中间液于１０mL棕色容量瓶中,用正己烷Ｇ异丙醇溶液(５􀆰１􀆰１１)稀释配 制成质量浓度分别为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和鞘磷脂:１０mg/L、３０mg/L、４５mg/L、９０mg/L、１８０ mg/L,磷脂酰胆碱:３０mg/L、９０mg/L、１３５mg/L、２７０mg/L、５４０mg/L;溶血磷脂酰胆碱:２０mg/L、６０ mg/L、９０mg/L、１８０mg/L、３６０mg/L的系列混合标准工作溶液,现用现配. ５􀆰４　材料 氨基固相萃取柱:１０００mg/６mL,或性能相当者. ６　仪器和设备 ６􀆰１　液相色谱仪:配蒸发光散射检测器. ６􀆰２　天平:感量为０􀆰１mg,０􀆰００１g和０􀆰０１g. ６􀆰３　涡旋振荡器. ６􀆰４　离心机:转速≥４０００r/min. ６􀆰５　氮吹仪. ６􀆰６　超声波清洗仪. ６􀆰７　固相萃取装置. ７　试样制备与保存 ７􀆰１　试样制备 湿基试样制备按照GB/T３０８９１—２０１４中附录B的规定执行;干制品试样至少２００g,粉碎后全部过 ０􀆰４２mm孔径分析筛,充分混匀后装入洁净容器中密封备用;油脂试样参照GB/T１５６８７的规定执行,分 取５０g装入洁净容器中密封备用. ７􀆰２　试样保存 ２SC/T３０５７—２０２２ －１８℃以下避光保存. ８　测定步骤 ８􀆰１　提取和净化 ８􀆰１􀆰１　固体试样 ８􀆰１􀆰１􀆰１　提取 湿基试样称取１g~２g(精确至０􀆰０１g),干制品试样称取０􀆰１g~０􀆰２g(精确至０􀆰００１g),置于５０mL 离心管中,加入１５mL氯仿Ｇ甲醇溶液(５􀆰１􀆰１３),涡旋混合后超声提取３０min,４０００r/min离心５min,收 集上清液,残渣再加入１５mL氯仿Ｇ甲醇溶液(５􀆰１􀆰１３)重复上述操作两次,合并上清液至分液漏斗中,加 入１０mL氯化钠溶液(５􀆰１􀆰１４),振荡摇匀后静置分层,收集下层提取液,加入适量无水硫酸钠(５􀆰１􀆰１０)脱 水过滤,３０℃氮吹至近干,加入２mL氯仿(５􀆰１􀆰３)溶解,待净化. ８􀆰１􀆰１􀆰２　净化 氨基固相萃取柱先用５mL氯仿活化,将待净化液移入氨基固相萃取柱(５􀆰４),依次用１０mL氯仿Ｇ异 丙醇溶液(５􀆰１􀆰１５)和１０mL乙酸－乙醚溶液(５􀆰１􀆰１６)淋洗小柱,再依次用１０mL甲醇和１０mL氯仿Ｇ甲 醇Ｇ盐酸溶液(５􀆰１􀆰１８)洗脱,收集全部洗脱液,于３０℃下氮吹至近干,加入正己烷－异丙醇溶液(５􀆰１􀆰１１) 溶解并定容至１０mL,过０􀆰４５μm尼龙滤膜后待测. ８􀆰１􀆰２　油脂试样 称取０􀆰２g~０􀆰５g油脂试样(精确至０􀆰００１g),加入氯仿(５􀆰１􀆰３)溶解并定容至１０mL,准确移取１ mL按照８􀆰１􀆰１􀆰２进行净化操作. ８􀆰２　测定 ８􀆰２􀆰１　色谱参考条件 a)　色谱柱:硅胶整体柱(１００mm×４􀆰６mm),或性能相当者; b)　柱温:３０℃; c)　进样量:２０μL; d)　流速:１􀆰５mL/min; e)　载气压力:５０PSI; f)　漂移管温度:６５℃,喷雾器:加热模式７５％; g)　流动相:A相０􀆰０４％三乙胺正己烷溶液(５􀆰１􀆰１９),B相异丙醇(５􀆰１􀆰４),C相１３％乙酸溶液 (５􀆰１􀆰２０);梯度洗脱程序见表１. 表１　流动相梯度洗脱程序 时间,min流动相,％ A相 B相 C相 ０􀆰０ ４０ ５７ ３ ８􀆰０ ４０ ５０ １０ １５􀆰０ ４０ ５０ １０ １５􀆰１ ４０ ５７ ３ ２０􀆰０ ４０ ５７ ３ ８􀆰２􀆰２　标准曲线绘制 将系列混合标准工作液(５􀆰３􀆰３)分别注入液相色谱仪中,以系列标准溶液中各磷脂质量浓度的对数值 为横坐标、以相应色谱峰峰面积的对数值为纵坐标,绘制标准曲线.５种磷脂混合标准工作溶液的液相色 谱图见附录B.标准曲线方程依蒸发光散射检测原理,按公式(１)计算. lgy＝blgx＋lga (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: y　———峰面积; ３S