2 0 2 3 1 2 2 2 发 布 － － 2 0 2 4 0 5 0 1 － － 实 施 地 方 流 行 性 牛 白 血 病 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 5 7 4 — 2 0 2 3 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r e n z o o t i c b o v i n e l e u k o s i s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 N Y / T 5 7 4 — 2 0 0 2NY/T５７４—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 本文件代替NY/T５７４—２００２«地方流行性牛白血病琼脂凝胶免疫扩散试验方法»,与NY/T５７４— ２００２相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　更改了本文件的适用范围(见第１章,２００２年版的第１章); b)增加了术语与定义(见第３章); c)增加了缩略语(见第４章); d)增加了临床诊断(见第５章); e)增加了样品采集、保存与运输(见第６章); f)增加了病原分离(见第７章); g)增加了巢式PCR(见第８章); h)增加了实时荧光PCR(见第９章); i)增加了阻断ELISA(见第１０章); j)增加了琼脂凝胶免疫扩散中试剂耗材、仪器设备、加样、孵育、实验成立条件(见１１􀆰１、１１􀆰２、 １１􀆰３􀆰３、１１􀆰３􀆰４、１１􀆰３􀆰５); k)更改了琼脂凝胶免疫扩散中琼脂平板制备(见１１􀆰３􀆰１,２００２年版的２􀆰２􀆰１)、打孔(见１１􀆰３􀆰２, ２００２年版的２􀆰２􀆰２)、结果判定(见１１􀆰３􀆰６,２００２年版的２􀆰３); l)增加了综合判定(见第１２章). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:中国动物疫病预防控制中心、青海省动物疫病预防控制中心、北京亿森宝生物科技 有限公司、重庆市动物疫病预防控制中心、上海市动物疫病预防控制中心、四川省动物疫病预防控制中心、 陕西省动物疫病预防控制中心、陕西省动物卫生与屠宰管理站. 本文件主要起草人:孙雨、王传彬、顾小雪、翟新验、杨林、刘颖昳、徐琦、毕一鸣、蔡金山、阚威、王新杰、 孙晓明、高姗姗、白雪冬、曾政、董春霞、骆璐、赵洪进、王建、杨显超、陈斌、陈弟诗、赵光明、朱宝、齐亚辉、孙 航、胡冬梅、冯冰. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２００２年首次发布为NY/T５７４—２００２«地方流行性牛白血病琼脂凝胶免疫扩散试验方法»; ———本次为第一次修订. ⅠNY/T５７４—２０２３ 地方流行性牛白血病诊断技术 １　范围 本文件规定了牛白血病的临床诊断、样品采集与处理、病原学和血清学方法的技术要求. 本文件适用于牛白血病的诊断、检测、检疫、监测和流行病学调查. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB１９４８９　实验室　生物安全通用要求 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 地方流行性牛白血病　enzooticbovineleukosis 一种以淋巴样细胞恶性增生,进行性恶病质变化和全身淋巴结肿大为特征的一种慢性、进行性、接触 传染性肿瘤病.由反转录病毒科肿瘤病毒亚科中的牛白血病病毒(Bovineleukaemiavirus,BLV)引起. ３􀆰２ 聚合酶链式反应　polymerasechainreaction 利用一段DNA为模板,在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下,将该段DNA扩增至足够数量,以 便进行结构和功能分析. ３􀆰３ 实时荧光PCR　realＧtimePCR 一种利用荧光信号、累积实时监测整个PCR进程的试验方法. ３􀆰４ Ct值　cyclethreshold 每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环次数. ３􀆰５ 琼脂凝胶免疫扩散　agargelimmunodiffusion 琼扩试验 在琼脂凝胶中进行的抗原抗体免疫沉淀反应,可用于血清学定型. ３􀆰６ 酶联免疫吸附试验　enzymeＧlinkedimmunosorbentassay 由酶分子与抗体分子共价结合形成酶标记抗体.此种结合不会改变抗体的免疫学特性,也不影响酶 的生物学活性.通过此种酶标记抗体与吸附在固相载体上的抗原发生特异性结合,当加入底物溶液后,底 物可在酶作用下出现显色反应.此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定,从而通过底物的显色反应来 判定有无相应的免疫反应. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. １NY/T５７４—２０２３ AGID:琼脂凝胶免疫扩散(agargelimmunodiffusion) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) EBL:地方流行性牛白血病(enzooticbovineleukosis) ELISA:酶联免疫吸附试验(enzymeＧlinkedimmunosorbentassay) FBL:胎牛肺细胞(fetalbovinelung) MEM:最低必需培养基(minimumessentialmedium) OD:光密度(opticaldensity) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline) PBMC:外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell) ５　临床诊断 ５􀆰１　易感动物 各年龄段牛(包括牦牛、水牛以及野生牛类)均易感,肿瘤(淋巴肉瘤)常见于３岁以上的牛. ５􀆰２　传播途径 牛的各种体液(鼻和支气管液、唾液、血液、精液、牛奶)中均存在BLV,可通过血源性传播、分泌物传 播、乳源性传播、寄生虫传播、精液和胚胎移植传播等多种途径传播,也可通过被血液污染的直肠检查用针 头、手术设备、手套以及吸血昆虫等机械性传播. ５􀆰３　临床症状 ５􀆰３􀆰１　地方流行型 潜伏期一般为４年~５年,多发生于３岁以上成年牛,４岁~８岁牛感染率最高.最急性病例无前驱 症状即死亡.亚急性病例病程多为７d至数月,表现为食欲减退、贫血和肌无力.当肿瘤广泛生长时,体 温可升高至３９􀆰５℃~４０℃,病牛表现为生长缓慢,全身体表淋巴结显著肿大而且坚硬,依部位不同可导 致病牛头偏向一侧,眼球突出,严重时被挤出眼眶,有的出现贫血,心脏受损,消化功能紊乱,流产、难产或 不孕,共济失调、麻痹等症状. ５􀆰３􀆰２　散发型 犊牛多见于４月龄以下,主要表现为淋巴结对称性肿大.青年牛多见于１８月龄~２０月龄,出现全身 淋巴结肿大,内脏特别是胸腺出现肿瘤,并伴有贫血和下痢,心和肝脏的肿瘤可导致病牛死亡. ５􀆰４　病理变化 剖检可见,淋巴结和某些器官肿瘤病变,瘤块外观肿大、灰红色、坚实、有弹性.肿瘤的发生分布每例 不一,成年牛多发体表淋巴结,膈肌、肠系膜、真胃、肌肉、心肌多有肿瘤病变.肿瘤的病理组织学表现为有 致密的基质及淋巴细胞和成淋巴细胞的大量增殖,患病组织有大量瘤细胞浸润、破坏并代替正常的组织 细胞. ５􀆰５　结果判定 易感动物符合５􀆰３、５􀆰４的规定,可初步判定为疑似病例.确诊应采集易感动物的血液或组织进行病 原学或血清学检测. ６　样品采集、保存与运输 ６􀆰１　总则 宜选择EBL发病期、具有典型临床症状的牛,进行样品采集.在采样过程中,应避免交叉污染.样品 采集、保存及运输应符合GB１９４８９的规定. ６􀆰２　样品采集 ６􀆰２􀆰１　抗凝血样品采集 采集牛静脉抗凝血５mL,来回颠倒几次,使抗凝剂与血液充分混合.使用商品化核酸提取试剂,提取 ２NY/T５７４—２０２３ 抗凝血中的PBMC. ６􀆰２􀆰２　组织器官样品采集 无菌采集典型肿瘤病变组织０􀆰５g~１􀆰０g,置于无菌采样袋或其他灭菌容器中,密封保存. ６􀆰２􀆰３　血清样品采集 无菌采集牛静脉血５mL,分离血清.将血清置于２mL无菌离心管中,加盖密封保存. ６􀆰３　样品保存和运输 样品采集后,应尽快置于保温箱中,加入预冷的冰袋,密封,宜２４h内送实验室检测.待检样品应尽 快处理,在４℃存放应不超过４d.样品在低温条件下保存时间稍长;样品若长期保存,应以－７０℃以下 条件为宜. ６􀆰４　样品处理 ６􀆰４􀆰１　抗凝血样品处理 使用商品化PBMC细胞提取试剂,提取抗凝血中的PBMC. ６􀆰４􀆰２　组织器官样品处理 加入０􀆰５mL~１mL０􀆰０１mol/L的PBS(pH７􀆰２),于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨,将组织 悬液转入无菌离心管中备用. ６􀆰４􀆰３　血清样品处理 血清样品以６０００r/min离心５min,取上清液待检. ７　病原分离 ７􀆰１　基本要求 除特殊说明外,本文件所有操作程序均应符合GB１９４８９的规定. ７􀆰２　试剂耗材 ７􀆰２􀆰１　除特殊说明外,本文件使用的化学试剂均为分析纯,水均为符合GB/T６６８２规定的二级水. ７􀆰２􀆰２　商品化Fico