2 0 2 3 1 2 2 2 发 布 － － 2 0 2 4 0 5 0 1 － － 实 施 兔 出 血 症 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 5 7 2 — 2 0 2 3 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r r a b b i t h a e m o r r h a g i c d i s e a s e Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 N Y / T 5 7 2 — 2 0 1 6 、 N Y / T 2 9 6 0 — 2 0 1 6NY/T５７２—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替NY/T５７２—２０１６«兔病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法»和NY/T２９６０—２０１６«兔 病毒性出血症病毒RTＧPCR检测方法»,与NY/T５７２—２０１６和NY/T２９６０—２０１６相比,除结构调整和 编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　增加了临床诊断(见第５章); b)更改了兔出血症病毒血凝和血凝抑制试验方法的试剂(见６􀆰２􀆰１,２０１６年版的３􀆰４和３􀆰５)、样品 (见６􀆰２􀆰２,２０１６年版的３􀆰５)、HA试验(见６􀆰２􀆰５,２０１６年版的第５章)、HI试验(见６􀆰２􀆰６,２０１６ 年版的第７章); c)删除了玻片血凝法(２０１６年版的第６章); d)更改了RTＧPCR试验的引物(见６􀆰３􀆰２􀆰１,２０１６年版的第５章)、RTＧPCR步骤(见６􀆰３􀆰４,２０１６年 版的６􀆰４、６􀆰５)、结果判定(见６􀆰３􀆰６,２０１６年版的第７章); e)增加了实时荧光定量RTＧPCR试验(见６􀆰４); f)增加了综合判定(见第７章). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:江苏省农业科学院、中国动物卫生与流行病学中心. 本文件主要起草人:王芳、胡波、宋艳华、王志亮、陈萌萌、邵卫星、魏后军、范志宇、仇汝龙、朱伟峰. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２００２年首次发布为NY/T５７２—２００２,２０１６年第一次修订; ———２０１６年首次发布为NY/T２９６０—２０１６,本次为第一次整合修订. ⅠNY/T５７２—２０２３ 兔出血症诊断技术 １　范围 本文件规定了兔出血症临床诊断、血凝和血凝抑制试验、RTＧPCR试验、实时荧光定量RTＧPCR试验 的技术要求. 本文件适用于兔出血症流行病学调查、诊断、检疫以及病原鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文 件. GB１９４８９　实验室　生物安全通用要求 NY/T５４１　兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. RHD１:兔出血症１型(rabbithaemorrhagicdiseasetype１) RHD２:兔出血症２型(rabbithaemorrhagicdiseasetype２) RHDV１:兔出血症病毒１型(rabbithaemorrhagicdiseasevirustype１) RHDV２:兔出血症病毒２型(rabbithaemorrhagicdiseasevirustype２) ５　临床诊断 ５􀆰１　易感动物 ５􀆰１􀆰１　兔出血症病毒１型(RHDV１)主要感染２月龄以上家兔并出现明显的临床症状. ５􀆰１􀆰２　兔出血症病毒２型(RHDV２)可感染家兔和野兔,家兔更易感,７日龄以上的哺乳仔兔出现明显的 临床症状和死亡.RHDV２对其他动物,如地中海松田鼠和白齿鼩等,也有易感性. ５􀆰２　临床症状 ５􀆰２􀆰１　兔出血症(RHD)具有高度传染性和致死率,病兔的死亡率可达７０％~９０％. ５􀆰２􀆰２　最急性型:主要表现为突然死亡,死前表现短暂的兴奋,突然倒地,划动四肢呈游泳状继之昏迷,濒 死时抽搐,角弓反张,典型病例可见鼻孔流出血样液体,肛门松驰,肛周有少量淡黄色黏液附着. ５􀆰２􀆰３　急性型:主要表现为精神不振,食欲减退,渴欲增加,呼吸迫促乃至呼吸困难.死前有短期兴奋、挣 扎、狂奔、咬笼,全身颤抖,四肢划动.肛门松弛,肛周有少量淡黄色黏液附着,少数病死兔鼻孔中流出血样 液体. ５􀆰２􀆰４　慢性型:主要表现为精神不振,食欲减退或废绝,消瘦严重,衰竭而死.少数耐过兔,则发育不良, 生长迟缓. ５􀆰２􀆰５　RHDV１感染死亡兔与RHDV２感染死亡兔的症状相似. ５􀆰３　剖检病变 ５􀆰３􀆰１　肝脏淤血、肿大、质脆,表面呈淡黄色或灰白色条纹,切面粗糙;脾脏淤血、肿大,呈黑紫色;肾脏肿 １NY/T５７２—２０２３ 大、淤血,并有出血点. ５􀆰３􀆰２　胸腺水肿、肿大、出血;肺脏有不同程度充血、淤血、水肿、出血;心脏淤血,心包膜有点状出血. ５􀆰３􀆰３　鼻腔、喉头和气管黏膜淤血、出血;气管和支气管内有泡沫状血液. ５􀆰３􀆰４　胃肠多充盈,浆膜出血;小肠黏膜充血、出血;肠系膜淋巴结水样肿大,其他淋巴结多数充血. ５􀆰３􀆰５　胸腔和腹腔有血液样渗出物. ５􀆰４　结果判定 出现５􀆰１、５􀆰２、５􀆰３的情况,初步判为兔出血症临床疑似病例,需要进一步开展实验室诊断. ６　实验室诊断 ６􀆰１　样品采集、保存、运输和处理 ６􀆰１􀆰１　总则 样品采集、保存和运输按照NY/T５４１的规定执行.涉及病原检测应在生物安全二级实验室操作,按 照GB１９４８９的规定执行. ６􀆰１􀆰２　组织样品采集 无菌采集病死兔肝脏组织,装入无菌采样袋或一次性灭菌的１５mL或５０mL离心管并编号. ６􀆰１􀆰３　样品保存和运输 样品采集后置于保温箱中,加入预冷的冰袋,密封,２４h内送实验室;如未能在２４h送达实验室,应冰 冻样品,加冰袋低温运输.样品应尽快处理,在２℃~８℃保存宜不超过２４h;若需长期保存,样品应放在 －７０℃以下冰箱中. ６􀆰１􀆰４　样品处理 ６􀆰１􀆰４􀆰１　取兔肝脏组织,剪碎、研磨或匀浆,按１g组织加１０mLPBS的比例配成悬液,反复冻融３次,再 以８０００r/min离心３０min,取上清液作为血凝和血凝抑制试验材料. ６􀆰１􀆰４􀆰２　取兔肝脏组织,剪碎、研磨或匀浆,按１g组织加１０mLDEPC水的比例配成悬液,反复冻融３ 次,再以８０００r/min离心３０min,取上清液作为核酸检测材料. ６􀆰２　血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验 ６􀆰２􀆰１　试剂 ６􀆰２􀆰１􀆰１　PBS配置方法应符合附录A中A􀆰３的规定. ６􀆰２􀆰１􀆰２　人“B”型或“O”型红细胞悬液(首选“B”型)应符合A􀆰４的规定. ６􀆰２􀆰１􀆰３　２５％高岭土悬液配方应符合A􀆰５的规定. ６􀆰２􀆰１􀆰４　抗兔出血症病毒１型特异性血清、抗兔出血症病毒２型特异性血清、阴性血清(SPF兔血清)　 血清需进行非特异性凝集和非特异性抑制因子处理,见附录B.用于抗原检测时,用PBS稀释将阳性血 清至HI效价为１∶６４~１∶２５６. ６􀆰２􀆰２　样品 待检兔肝脏悬液、阳性对照RHD１病死兔肝脏悬液(或RHDV１重组VP６０蛋白)、阳性对照RHD２病死 兔肝脏悬液(或RHDV２重组VP６０蛋白)、阴性对照健康兔肝脏悬液. ６􀆰２􀆰３　RHDV１重组VP６０蛋白的制备 将重组兔出血症病毒１型VP６０杆状病毒接种Sf９昆虫细胞,５d后,收集细胞培养物,反复冻融３次 后,以３０００r/min离心５min,取上清液即为RHDV１重组VP６０蛋白,置于２℃~８℃条件下备用. ６􀆰２􀆰４　RHDV２重组VP６０蛋白的制备 将重组兔出血症病毒２型VP６０杆状病毒接种Sf９昆虫细胞,５d后,收集细胞培养物,反复冻融３次 后,以３０００r/min离心５min,取上清液即为RHDV２重组VP６０蛋白,置于２℃~８℃条件下备用. ６􀆰２􀆰５　HA试验 ６􀆰２􀆰５􀆰１　在９６孔U型微量反应板上,从第２孔至第２１孔,每孔加入２５μLPBS. ２NY/T５７２—２０２３ ６􀆰２􀆰５􀆰２　在第１、第２孔加入待检兔肝脏悬液２５μL. ６􀆰２􀆰５􀆰３　从第２孔开始,充分混合后用２５μL微量移液器等量倍比稀释至第２１孔,稀释后第２１孔弃去 ２５μL. ６􀆰２􀆰５􀆰４　第２２孔加入RHD１病死兔肝脏悬液(或RHDV１重组VP６０蛋白)２５μL、第２３孔加入RHD２ 病死兔肝脏悬液(或RHDV２重组VP６０蛋白)２５μL作为阳性对照,第２４孔加入健康兔肝脏悬液２５μL 为阴性对照. ６􀆰２􀆰５􀆰５　每孔加１％人红细胞２５μL,立即置于微型振荡器上摇匀,于２℃~８℃静置４５min~６０min, 待阴性对照孔中红细胞完全沉积后观察结果. ６􀆰２􀆰５􀆰６　结果判定.当RHD１病死兔肝脏悬液(或RHDV１重组VP６０蛋白)、RHD２病死兔肝脏悬液 (或RHDV２重组VP６０蛋白)阳性对照红细胞１００％凝集,健康兔肝脏悬液红细胞１００％沉积时,试验成 立.被检样品红细胞１００％凝集的最高稀释度作为其血凝效价,HA效价≥１∶８０判为阳性