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2 0 2 3 0 2 1 7 发 布 - - 2 0 2 3 0 6 0 1 - - 实 施 鸭 甲 型 病 毒 性 肝 炎 1 型 和 3 型 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 : X X X X - X X X X I C S 1 1 . 2 2 0 C C S B 5 5 4 — 2 0 2 3 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r d u c k A v i r a l h e p a t i t i s 1 a n d 3 N Y / T 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 N Y / T 5 5 4 — 2 0 0 2NY/T554—2023 前  言 本文件按照GB/T1􀆰1—2020«标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替NY/T554—2002«鸭病毒性肝炎诊断技术»,与NY/T554—2002相比,除结构调整和编 辑性改动外,主要技术变化如下: a) 增加了临床症状和病理变化(见第5章); b)增加了病毒的分离(见第6章); c)增加了DHAVG1和DHAVG3RTGPCR(见第7章); d)增加了DHAVG1和DHAVG3RTGqPCR(见第8章); e)增加了DHAVG1病毒中和试验(见第9章); f)增加了DHAVG1血清中和试验(见第9章); g)增加了DHAVG1和DHAVG3抗体的胚胎中和试验(见第10章); h)删除了雏鸭接种/保护试验(见2002年版的第2章); i)删除了鸭(鸡)胚接种/中和试验(见2002年版的第3章). 本文件推荐的临床症状和病理变化、病毒分离、RTGPCR、RTGqPCR、病毒中和试验、血清中和试验方 法与WOAH推荐的相应方法基本一致. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口. 本文件起草单位:华南农业大学、中国农业大学、山东省滨州畜牧兽医研究院. 本文件主要起草人:郭霄峰、罗均、张大丙、王笑言、沈志强、王文秀、王金良. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2002首次发布为NY/T554—2002; ———本次为第一次修订. ⅠNY/T554—2023 鸭甲型病毒性肝炎1型和3型诊断技术 1 范围 本文件规定了鸭甲肝病毒1型和3型在鸭胚中的分离、RTGPCR鉴定、RTGqPCR鉴定;鸭甲肝病毒1 型的微量中和试验鉴定、抗体的微量中和试验检测和胚胎中和试验方法;鸭甲肝病毒3抗体的胚胎中和试 验方法. 本文件适用于鸭甲型病毒性肝炎1型和3型的诊断与检疫. 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件. 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件. DHAV:鸭甲肝病毒(DuckHepatitisAVirus) DEF:鸭胚成纤维细胞(DuckEmbryoFibroblasts) DEL:鸭胚肝细胞(DuckEmbryoLiverCells) DEEC:鸭胚上皮细胞(DuckEmbryoEpithelialCells) CPE:细胞病变(CytopathicEffect) DMEM:杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′sModifiedEagleMedium) TCID50:半数细胞培养感染量(MedianTissueCultureInfectiveDose) W/V:重量体积比(Weight/Volume) RTGPCR:反转录G聚合酶链反应(ReverseTranscriptionGPolymeraseChainReaction) PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSaline) RTGqPCR:荧光定量PCR(quantitativerealGtimePCR) 5 临床诊断 5􀆰1 临床症状 5􀆰1􀆰1 该病主要发生于3周龄以内的雏鸭,并且以1周龄内的雏鸭为主.感染鸭发病急、传播快、病死 率高. 5􀆰1􀆰2 发病初期,病鸭精神萎靡,食欲减退或废绝,眼半闭呈昏睡状,头触地;12h~24h后,病鸭出现神 经症状,表现为运动失调、身体倒向一侧、两脚痉挛,死前头向背部扭曲,两腿伸直、向后张开,呈典型的角 弓反张状. 5􀆰1􀆰3 最急性病鸭常未见任何异常而突然抽搐痉挛死亡. 5􀆰2 病理变化 5􀆰2􀆰1 大体病变主要为肝脏肿大、质地易脆,表面呈黄红色或花斑状,并有特征性的点状出血或刷状 出血. 5􀆰2􀆰2 多数病例可见胆囊肿胀、胆汁充盈,部分病例脾脏肿大. 5􀆰2􀆰3 急性病例的组织学病变表现为肝细胞坏死、变性和淋巴细胞浸润,慢性病例或耐过鸭常见不同程 1NY/T554—2023 度的空泡变性和淋巴细胞聚集. 5􀆰3 结果判定 凡具有5􀆰1临床症状和5􀆰2病理变化的病鸭,初步判定为疑似鸭病毒性肝炎. 6 病毒分离 6􀆰1 仪器设备 6􀆰1􀆰1 冷冻台式离心机. 6􀆰1􀆰2 照蛋器. 6􀆰1􀆰3 恒温培养箱. 6􀆰1􀆰4 1mL注射器及针头. 6􀆰1􀆰5 手术剪. 6􀆰1􀆰6 镊子. 6􀆰1􀆰7 研钵. 6􀆰2 耗材 0􀆰22μm细菌滤器. 6􀆰3 试剂 6􀆰3􀆰1 青霉素. 6􀆰3􀆰2 链霉素. 6􀆰3􀆰3 卡那霉素. 6􀆰3􀆰4 PBS溶液,按照附录A的规定配制. 6􀆰3􀆰5 50%甘油生理盐水. 6􀆰4 胚胎 10日龄~12日龄DHAVG1或DHAVG3抗体阴性鸭胚. 6􀆰5 样品采集 6􀆰5􀆰1 采集感染初期或发病急性期病鸭的肝脏. 6􀆰5􀆰2 送检病料置于灭菌的50%甘油生理盐水中. 6􀆰6 样品保存 6􀆰6􀆰1 采集的样品若在48h内处理,可于4℃保存. 6􀆰6􀆰2 或尽快置于-20℃以下保存(-70℃储存最好). 6􀆰7 样品处理 6􀆰7􀆰1 组织样品于研钵中研磨后加入5倍~10倍pH7􀆰2~7􀆰4的PBS溶液,制成组织悬浮液.然后 3000r/min4℃离心30min,取上清液作为接种材料. 6􀆰7􀆰2 为防止细菌污染,可在样品液中加入青霉素1000IU/mL、链霉素1000μg/mL和卡那霉素1000 μg/mL,于37℃温箱中作用30min.或采用0􀆰22μm细菌滤器对上述病料样品液作滤过除菌. 6􀆰7􀆰3 对处理的样品作无菌检验. 6􀆰8 鸭胚接种 6􀆰8􀆰1 取已处理并且无菌检验合格的样品,经尿囊腔接种10日龄~12日龄的非免疫鸭胚,每枚鸭胚接 种0􀆰2mL病毒液,每个样品接种4枚~5枚鸭胚.将已接种病毒的鸭胚置于37℃恒温培养箱中孵育. 6􀆰8􀆰2 弃去接种后24h内死亡的鸭胚.对24h内未死亡的鸭胚,每间隔6h观察胚胎的死亡情况.收 集24h~96h死亡鸭胚,放入4℃冰箱中静置4h~12h,待鸭胚血管收缩,进行鸭胚剖检. 6􀆰9 胚胎病变 胚胎大体病变为发育迟滞、全身皮下出血、腹部和后肢水肿.胚肝呈黄红色、肿胀,并可能有坏死灶. 2NY/T554—2023 6􀆰10 病毒收获 无菌收取24h~96h内的死胚或活胚的尿囊液和肝脏,-20℃保存备用. 7 RTGPCR检测 7􀆰1 仪器 7􀆰1􀆰1 冷冻离心机. 7􀆰1􀆰2 凝胶成像系统. 7􀆰1􀆰3 PCR仪. 7􀆰2 耗材 7􀆰2􀆰1 RNaseGFree离心管. 7􀆰2􀆰2 0􀆰2mL的指形管. 7􀆰2􀆰3 1􀆰5mL的指形管. 7􀆰3 试剂 7􀆰3􀆰1 DHAVG1上下游引物. 7􀆰3􀆰2 DHAVG3上下游引物. 7􀆰3􀆰3 RNA抽提试剂盒. 7􀆰3􀆰4 逆转录酶. 7􀆰3􀆰5 dNTPs. 7􀆰3􀆰6 TaqDNA酶. 7􀆰3􀆰7 琼脂糖. 7􀆰3􀆰8 1000bpDNALadder. 7􀆰3􀆰9 PBS溶液,按照附录A中A􀆰1的规定配制. 7􀆰3􀆰10 氯仿. 7􀆰3􀆰11 70%的乙醇. 7􀆰3􀆰12 RNaseGFreeddH2O. 7􀆰3􀆰13 阳性核酸对照. 7􀆰3􀆰14 阴性核酸对照. 7􀆰4 DHAV的检测 7􀆰4􀆰1 引物 DHAVG1F:AAGAAGGAGAAAATY(C或T)AAGGAAGG; DHAVG1R:TTGATGTCATAGCCCAAS(C或G)ACAGC; 扩增3D基因片段,长度为467bp. DHAVG3F:TGGCTATTGACTTTGGCTT; DHAVG3R:TGTTATGGACTGGAACCACT; 扩增5′UTR区域,扩增长度为292bp. 7􀆰4􀆰2 病料的处理 以无菌术式收集病鸭的肝脏,或胚胎的肝脏、尿囊液.肝脏样品在组织研磨器中研磨成乳糜状,加 PBS制成10%(W/V)悬浮液.肝脏悬浮液或尿囊液经12000r/min4℃离心15min,取上清液备用. 7􀆰4􀆰3 病毒核酸的抽提 7􀆰4􀆰3􀆰1 用RNA抽提试剂盒提取病毒的RNA.取250μL尿囊液或肝组织研磨上清液于一新的 RNaseGFree离心管中,加入750μL裂解液,剧烈振荡,室温下静置5min. 7􀆰4􀆰3􀆰2 随后加200μL氯仿,剧烈振荡15s,室温下放置2min. 3NY/T554—2023 7􀆰4􀆰3􀆰3 12000r/min4℃离心15min,取上清液于另一支离心管中.加入等体积的70%乙醇,混匀. 再将溶液转移到吸附柱中. 7􀆰4􀆰3􀆰4 12000r/min4℃离心60s,弃掉滤液(溶液较多的情况下,可多次进行).向吸附柱中加入350 μL去蛋白溶

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