2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 猪 传 染 性 胃 肠 炎 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 5 4 8 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r p o r c i n e t r a n s m i s s i b l e g a s t r o e n t e r i t i s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 N Y / T 5 4 8 — 2 0 1 5NY/T５４８—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替NY/T５４８—２０１５«猪传染性胃肠炎诊断技术»,与NY/T５４８—２０１５相比,除结构调整和 编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　增加了样品采集与处理(见第７章); b)增加了间接免疫荧光法(见第１０章); c)增加了实时荧光反转录聚合酶链式反应(见第１３章); d)删除了血清中和试验中的常量法(见２０１５年版的６􀆰６􀆰４􀆰２); e)更改了间接酶链免疫吸附试验(见第１５章,２０１５年版的６􀆰７); f)增加了综合判定(见第１６章). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、黑龙江八一农垦大学. 本文件主要起草人:冯力、陈建飞、张鑫、时洪艳、郭龙军、石达、孙东波. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２００２年首次发布为NY/T５４８—２００２,２０１５年第一次修订; ———本次为第二次修订. ⅠNY/T５４８—２０２５ 猪传染性胃肠炎诊断技术 １　范围 本文件规定了猪传染性胃肠炎的临床诊断、样品采集与处理和实验室诊断方法的技术要求. 本文件适用于猪传染性胃肠炎的诊断、监测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB１９４８９　实验室　生物安全通用要求 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. CPE:细胞病变作用(Cytopathiceffect) DAPI:４′,６Ｇ二脒基Ｇ２Ｇ苯基吲哚(４′,６ＧdiamidinoＧ２Ｇphenylindole) DIFA:直接免疫荧光法(Directimmunofluorescenceassay) ELISA:酶联免疫吸附试验(EnzymeＧlinkedimmunosorbentassay) FA:荧光抗体(FITCＧlabeledantibody) FITC:异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate) IDIFA:间接免疫荧光法(Indirectimmunofluorescenceassay) PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsaline) PRCV:猪呼吸道冠状病毒(Porcinerespiratorycoronavirus) RealＧtimeRTＧPCR:荧光定量反转录Ｇ聚合酶链式反应(RealＧtimereversetranscriptionＧpolymerase chainreaction) RTＧPCR:反转录Ｇ聚合酶链式反应(ReversetranscriptionＧpolymerasechainreaction) TGE:猪传染性胃肠炎(Transmissiblegastroenteritis) TGEV:猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus) ５　临床诊断 ５􀆰１　流行病学 ５􀆰１􀆰１　TGE一年四季均可发生,一般多发生在冬季和春季. ５􀆰１􀆰２　TGE潜伏期较短,通常为１８h~３d.传播迅速,２d~３d可波及整个猪群. ５􀆰１􀆰３　TGE有暴发流行、地方流行和周期性地方流行３种形式. ５􀆰１􀆰４　若感染了TGEV变异株PRCV,则会出现不同的流行模式,从而使TGE的流行更加复杂化. ５􀆰１􀆰５　各种年龄的猪均可感染,尤其是１０日龄以内的哺乳仔猪,发病率和死亡率可高达１００％. ５􀆰１􀆰６　病猪、带毒猪和隐性感染猪是本病的主要传染源. ５􀆰１􀆰７　病毒通过粪Ｇ口途径、气溶胶或感染母猪的乳汁进行传播. １NY/T５４８—２０２５ ５􀆰２　临床症状 ５􀆰２􀆰１　新生仔猪表现为呕吐、水样腹泻、脱水、体重迅速下降.腹泻严重的仔猪,呕吐物中常出现未消化 的乳凝块.粪便腥臭,病程短,症状出现后２d~７d死亡. ５􀆰２􀆰２　３周龄仔猪、生长期猪和出栏期猪感染时仅表现厌食,腹泻程度较轻,持续期相对较短,偶尔伴有 呕吐,极少发生死亡. ５􀆰２􀆰３　泌乳母猪发病,则一过性体温升高、呕吐、腹泻、厌食、无乳或泌乳量急剧减少. ５􀆰３　病理变化 ５􀆰３􀆰１　肉眼可见的病理变化常局限于消化道,特别是胃和小肠.胃膨胀,胃内充满凝乳块,胃黏膜充血或 出血,胃大弯部黏膜淤血.小肠壁弛缓、膨满,肠壁菲薄呈半透明.小肠内容物呈黄色、透明泡沫状的液 体,含有凝乳块.哺乳仔猪肠系膜淋巴管的乳糜管消失. ５􀆰３􀆰２　组织学变化主要以空肠为主,从胃至直肠呈广范围的渗出性卡他性炎症变化.其特征是肠绒毛萎 缩变短(见附录A中的图A􀆰１),回肠变化稍轻微.小肠变化有较明显的年龄特征,新生猪变化严重. ５􀆰３􀆰３　电子显微镜观察,可见小肠上皮细胞的微绒毛、线粒体、内质网以及其他细胞质内的成分变性.在 细胞质空泡内有病毒粒子存在. ５􀆰４　结果判定 符合５􀆰１且满足５􀆰２或５􀆰３的病例,可判为TGE疑似病例.确诊应采集有典型临床症状猪只的粪 便、小肠及其内容物进行实验室诊断. ６　生物安全措施 进行猪传染性胃肠炎的诊断、检测时,如动物剖检、样品采集与处理、核酸处理等,按照GB１９４８９的 规定执行. ７　样品采集与处理 ７􀆰１　仪器设备 ７􀆰１􀆰１　手术刀、剪刀和镊子. ７􀆰１􀆰２　微量移液器及配套吸头. ７􀆰１􀆰３　振荡器. ７􀆰１􀆰４　组织匀浆器. ７􀆰１􀆰５　台式低温高速离心机. ７􀆰１􀆰６　冰箱(－２０℃). ７􀆰２　试剂材料 ７􀆰２􀆰１　０􀆰０２mol/LpH７􀆰２磷酸盐缓冲液(PBS),配制方法按照附录B中B􀆰１的规定执行. ７􀆰２􀆰２　青霉素(１０００００IU/L). ７􀆰２􀆰３　链霉素(１０００００μg/L). ７􀆰２􀆰４　医用防护服. ７􀆰２􀆰５　样品保存管(２mL、２５mL、５０mL). ７􀆰２􀆰６　离心管(２mL、１５mL、５０mL). ７􀆰３　样品采集 ７􀆰３􀆰１　粪便 选取临床症状典型的发病猪只,用灭菌注射器吸取其粪便１mL~２mL或轻轻挤压发病猪的腹部,从 其肛门处采集１mL~２mL粪便,放入含等体积无菌PBS(含终浓度１０００IU/mL青霉素、１０００μg/mL 链霉素)的样品保存管中,－２０℃保存. ２NY/T５４８—２０２５ ７􀆰３􀆰２　小肠及其内容物 用手术刀剖开病死猪腹腔,分别在十二指肠和直肠两端结扎并在结扎线外端剪断,然后放入样品保存 管,－２０℃保存. ７􀆰４　样品处理 ７􀆰４􀆰１　粪便 将含粪便的样品保存管在室温解冻,剧烈振荡(２０００r/min)３min~５min,４℃条件下,３０００r/min 离心３０min,取上清液进行检测或－２０℃保存备用. ７􀆰４􀆰２　小肠及其内容物 将小肠及其内容物匀浆,用含终浓度１００００IU/mL青霉素、１００００μg/mL链霉素的无菌PBS制成５ 倍悬液,４℃条件下,３０００r/min离心３０min,取上清液进行检测或－２０℃保存备用. ８　病毒分离与鉴定 ８􀆰１　仪器设备 ８􀆰１􀆰１　二级生物安全柜. ８􀆰１􀆰２　倒置显微镜. ８􀆰１􀆰３　冰箱(２℃~８℃、－２０℃). ８􀆰１􀆰４　台式低温高速离心机. ８􀆰１􀆰５　微量移液器及配套吸头. ８􀆰１􀆰６　CO２恒温培养箱. ８􀆰２　试剂材料 ８􀆰２􀆰１　细胞培养液,配制方法按照B􀆰２的规定执行. ８􀆰２􀆰２　病毒培养液,配制方法按照B􀆰３的规定执行. ８􀆰２􀆰３　０􀆰２５％胰酶. ８􀆰２􀆰４　微孔滤膜. ８􀆰２􀆰５　细胞培养瓶. ８􀆰２􀆰６　PK１５或ST细胞系. ８􀆰３　样品制备 取７􀆰４上清液,经０􀆰２２μm微孔滤膜过滤,获得过滤液,分装,立即使用或－２０℃保存备用. ８􀆰４　病毒分离 ８􀆰４􀆰１　细胞单层制备 按常规方法将PK１５或ST细胞分装到２５cm２或７５cm２细胞培养瓶中,每瓶分装细胞悬液５mL或 １５mL,细胞浓度为２×１０５个/mL~３×１０５个/mL,３７℃静置培养４８h~７２h. ８􀆰４􀆰２　接种及观察 用病毒培养液对PK１５或ST细胞单层轻轻洗３遍.取８􀆰３中过滤液０􀆰５mL(１􀆰５mL)接种于 ２５cm２(７５cm２)细胞单层上,同时加０􀆰２５mL(０􀆰７５mL)病毒培养液、混匀,３７℃吸附１h,补加病毒培养 液至５mL(１５mL).正常细胞对照,２５cm２(７５cm２)细胞培养瓶加５mL(