2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 猪 流 行 性 腹 泻 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 5 4 4 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r p o r c i n e e p i d e m i c d i a r r h e a Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 N Y / T 5 4 4 — 2 0 1 5NY/T５４４—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替NY/T５４４—２０１５«猪流行性腹泻诊断技术»,与NY/T５４４－２０１５相比,除结构调整和编 辑性改动外,主要技术变化如下: a)　增加了样品采集与处理(见第７章); b)增加了间接免疫荧光法(见第１０章); c)增加了实时荧光反转录Ｇ聚合酶链式反应(见第１３章); d)更改了间接酶联免疫吸附试验(见第１５章,２０１５年版的６􀆰６); e)增加了综合判定(见第１６章); 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、黑龙江八一农垦大学. 本文件主要起草人:冯力、陈建飞、时洪艳、张鑫、郭龙军、石达、孙东波. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２００２年首次发布为NY/T５４４－２００２,２０１５年第一次修订; ———本次为第二次修订. ⅠNY/T５４４—２０２５ 猪流行性腹泻诊断技术 １　范围 本文件规定了猪流行性腹泻的临床诊断、样品采集与处理和实验室诊断方法的技术要求. 本文件适用于猪流行性腹泻的诊断、监测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB１９４８９　实验室　生物安全通用要求 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. CPE:细胞病变作用(Cytopathiceffect) DAPI:４′,６Ｇ二脒基Ｇ２Ｇ苯基吲哚(４′,６ＧdiamidinoＧ２Ｇphenylindole) DIFA:直接免疫荧光法(Directimmunofluorescenceassay) ELISA:酶联免疫吸附试验(EnzymeＧlinkedimmunosorbentassay) FA:荧光抗体(FITCＧlabeledantibody) FITC:异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate) IDIFA:间接免疫荧光法(Indirectimmunofluorescenceassay) PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsaline) PED:猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea) PEDV:猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus) RealＧtimeRTＧPCR:实时荧光反转录、聚合酶链式反应(RealＧtimereversetranscriptionＧpolymerase chainreaction) RTＧPCR:反转录Ｇ聚合酶链式反应(ReversetranscriptionＧpolymerasechainreaction) ５　临床诊断 ５􀆰１　流行病学 ５􀆰１􀆰１　PED一年四季均可发生,主要发生在寒冷季节. ５􀆰１􀆰２　不同日龄的猪均可感染,尤其是７日龄以内的哺乳仔猪,发病率和死亡率可高达１００％. ５􀆰１􀆰３　病猪、带毒猪和隐性感染猪是主要传染源. ５􀆰１􀆰４　病毒通过粪Ｇ口途径、带毒母猪乳汁、胎盘、空气进行传播.病毒常存在于粪便中,污染环境、饲料、 饮水和用具等. ５􀆰２　临床症状 ５􀆰２􀆰１　病猪通常表现为呕吐,多发生在吮乳或吃食后,吐出的胃内容物呈黄色或乳白色.伴随着水样腹 泻,腹泻物呈黄色、灰色,或呈水样,顺肛门流出,沾污臀部及活动区域. １NY/T５４４—２０２５ ５􀆰２􀆰２　哺乳仔猪表现脱水、眼窝下陷、行走蹒跚、精神沉郁、扎堆蜷缩在母猪腹部、食欲减退或停食. ５􀆰２􀆰３　死淘与猪只日龄大小有关.７日龄以内哺乳仔猪在发生腹泻３d~４d后,常因严重脱水而死亡. ５􀆰２􀆰４　断奶仔猪、育肥猪症状较轻,表现精神不振、厌食,持续腹泻２d~３d后逐渐恢复正常,少数猪生 长发育不良. ５􀆰２􀆰５　成年猪、母猪表现为厌食、一过性腹泻,少数表现为呕吐或流产. ５􀆰３　病理变化 ５􀆰３􀆰１　肉眼可见的病理变化只限于小肠,可见小肠膨胀,肠壁变薄,外观明亮,肠管内有黄色或灰色液体 或带有气体. ５􀆰３􀆰２　肠系膜充血及肠系膜淋巴结肿大. ５􀆰３􀆰３　组织学检查可见小肠绒毛细胞的空泡形成和脱落,肠绒毛萎缩、变短(见附录A中的图A􀆰１),绒 毛高度与隐窝深度从正常的７∶１降低为３∶１. ５􀆰３􀆰４　超微结构的变化,主要发生在肠细胞的胞浆,可见细胞器的减少,产生电子半透明区,微绒毛终末 网消失. ５􀆰３􀆰５　小肠细胞变得扁平、脱落.在结肠也可见到细胞变化,但未见到脱落. ５􀆰４　结果判定 符合５􀆰１且满足５􀆰２或５􀆰３的病例,可判为PED疑似病例.确诊应采集有典型临床症状猪只的粪 便、小肠及其内容物进行实验室诊断. ６　生物安全措施 进行猪流行性腹泻的诊断、检测时,如动物剖检、样品采集与处理、核酸处理等,按照GB１９４８９的规 定执行. ７　样品采集与处理 ７􀆰１　仪器设备 ７􀆰１􀆰１　手术刀、剪刀和镊子. ７􀆰１􀆰２　微量移液器及配套吸头. ７􀆰１􀆰３　振荡器. ７􀆰１􀆰４　组织匀浆器. ７􀆰１􀆰５　台式低温高速离心机. ７􀆰１􀆰６　冰箱(－２０℃). ７􀆰２　试剂材料 ７􀆰２􀆰１　０􀆰０２mol/LpH７􀆰２磷酸盐缓冲液(PBS),配制方法按照附录B中的B􀆰１的规定执行. ７􀆰２􀆰２　青霉素(１０００００IU/L). ７􀆰２􀆰３　链霉素(１０００００μg/L). ７􀆰２􀆰４　医用防护服. ７􀆰２􀆰５　样品保存管(２mL、２５mL、５０mL). ７􀆰２􀆰６　离心管(２mL、１５mL、５０mL). ７􀆰３　样品采集 ７􀆰３􀆰１　粪便 选取临床症状典型的发病猪只,用灭菌注射器吸取其粪便１mL~２mL或轻轻挤压发病猪的腹部,从 其肛门处采集１mL~２mL粪便,放入含等体积无菌PBS(含终浓度１０００IU/mL青霉素、１０００μg/mL 链霉素)的样品保存管中,于－２０℃保存. ２NY/T５４４—２０２５ ７􀆰３􀆰２　小肠及其内容物 用手术刀剖开病死猪腹腔,分别在十二指肠和直肠两端结扎并在结扎线外端剪断,然后放入样品保存 管,于－２０℃保存. ７􀆰４　样品处理 ７􀆰４􀆰１　粪便 将含粪便的样品保存管在室温解冻,剧烈振荡(２０００r/min)３min~５min,４℃条件下３０００r/min 离心３０min,取上清液进行检测或于－２０℃保存备用. ７􀆰４􀆰２　小肠及其内容物 将小肠及其内容物匀浆,用含终浓度１０００IU/mL青霉素、１０００μg/mL链霉素的无菌PBS制成５ 倍悬液,４℃条件下３０００r/min离心３０min,取上清液进行检测或于－２０℃保存备用. ８　病毒分离与鉴定 ８􀆰１　仪器设备 ８􀆰１􀆰１　二级生物安全柜. ８􀆰１􀆰２　倒置显微镜. ８􀆰１􀆰３　冰箱(２℃~８℃、－２０℃). ８􀆰１􀆰４　台式低温高速离心机. ８􀆰１􀆰５　微量移液器及配套吸头. ８􀆰１􀆰６　CO２恒温培养箱. ８􀆰２　试剂材料 ８􀆰２􀆰１　细胞培养液,配制方法按照B􀆰２的规定执行. ８􀆰２􀆰２　病毒培养液,配制方法按照B􀆰３的规定执行. ８􀆰２􀆰３　０􀆰２５％胰酶. ８􀆰２􀆰４　微孔滤膜. ８􀆰２􀆰５　细胞培养瓶. ８􀆰２􀆰６　Vero细胞系. ８􀆰３　样品制备 取７􀆰４上清液,经０􀆰２２μm微孔滤膜过滤除菌,获得过滤液,立即使用或于－２０℃保存备用. ８􀆰４　病毒分离 ８􀆰４􀆰１　细胞单层制备 按常规方法将Vero细胞悬液分装到２５cm２或７５cm２的细胞培养瓶中,每瓶５mL或１５mL,细胞浓 度为２×１０５个/mL~３×１０５个/mL,３７℃静置培养４８h~７２h. ８􀆰４􀆰２　接种及观察 用病毒培养液对Vero细胞单层轻轻洗３遍.取８􀆰３中过滤液０􀆰５mL(１􀆰５mL)接种于２５cm２ (７５cm２)细胞单层上,同时加０􀆰２５mL(０􀆰７５mL)病毒培养液、混匀,３７℃吸附１h,补加病毒培养液至 ５mL(１５mL).正常细胞对照,２５cm２(７５cm２)细胞培养瓶加５mL(１５mL)病毒培养液,３７℃静置培养. 接种后,逐日观察CPE,连续７２h~９６h,记录CPE.若有CPE,收获细胞/病毒液,置于－２０℃保存备用. ８􀆰４􀆰３　盲传 如接种细胞未出现CPE,则收获细胞/病毒液,按８􀆰４􀆰２方法进行盲传,根据CPE变化情况可盲传２ 代~３代. ８􀆰５　结果判定 ８􀆰５􀆰１　CPE观察结果 ３NY/T５４４—２０２５ 接种细胞面粗糙