2 0 2 3 0 2 1 7 发 布 － － 2 0 2 3 0 6 0 1 － － 实 施 鸡 病 毒 性 关 节 炎 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 5 4 0 — 2 0 2 3 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r a v i a n v i r a l a r t h r i t i s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 N Y / T 5 4 0 — 2 0 0 2NY/T５４０—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替NY/T５４０—２００２«鸡病毒性关节炎琼脂凝胶免疫扩散试验方法»,与NY/T５４０—２００２ 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　增加了引言; b)增加了规范性引用文件(见第２章); c)增加了术语和定义(见第３章); d)增加了缩略语(见第４章); e)增加了临床诊断(见第５章); f)增加了样品采集和处理(见第６章); g)删除了琼脂凝胶免疫扩散试验(见２００２年版的第２章); h)增加了病毒分离与鉴定(见第７章); i)增加了RTＧPCR试验(见第８章); j)增加了实时荧光RTＧPCR试验(见第９章); k)增加了间接ELISA(见第１０章); l)增加了综合判断(见第１１章). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:中国动物卫生与流行病学中心、山东农业大学、青岛易邦生物工程有限公司. 本文件主要起草人:李阳、于晓慧、唐熠、刘东、刘朔、左媛媛、蒋文明、李金平、张富友、苏红、王楷宬、王 素春、王一新、王静静、侯广宇、刁有祥、刘华雷. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２００２年首次发布为NY/T５４０—２００２; ———本次为第一次修订. ⅠNY/T５４０—２０２３ 引　　言 鸡病毒性关节炎,又称病毒性腱鞘炎或滑液囊炎,是由不同血清型及致病型的禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus,ARV)感染引起的鸡或火鸡的一种传染病.该病传播速度快、发病范围广,不同日龄、不同品种 的鸡均可感染,但对商品肉鸡的危害尤为严重,给我国肉鸡养殖业造成严重经济损失.农业农村部将本病 列为三类动物疫病. 该病一年四季均可流行,以冬季多发,呈散发或地方性流行.病鸡和带毒禽是主要的传染源,可通过 消化道和呼吸道传播.同时,病鸡在鸡群中既能水平传播,也能经蛋垂直传播.临床上多见于４周龄~１６ 周龄的鸡,尤以４周龄~７周龄多发,以跛行、关节炎、腱鞘炎、腓肠肌肌腱断裂为主要特征.禽呼肠孤病 毒在分类地位上属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属,病毒粒子呈二十面体对称排列,有双层衣壳结构,无 囊膜,直径约７５nm,一般无血凝特性.病毒的基因组为分节段的双股RNA,由大小不同的３个类别的１０ 个节段组成. 鸡病毒性关节炎目前仍是严重威胁养禽业健康发展的重要疫病,近年来呈现新的流行特点,流行毒株 也不断变异,存在多种血清型和基因型的病毒同时流行.随着近些年科技的进步,原有的标准已不能满足 当前我国鸡病毒性关节炎诊断的技术需求,需要对原标准进一步完善. ⅡNY/T５４０—２０２３ 鸡病毒性关节炎诊断技术 １　范围 本文件规定了鸡病毒性关节炎的临床诊断、病毒分离与鉴定、反转录Ｇ聚合酶链式反应(RTＧPCR)、实 时荧光RTＧPCR(RealＧtimeRTＧPCR)和间接ELISA抗体检测方法的技术要求. 本文件适用于鸡病毒性关节炎的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB１９４８９　实验室生物安全通用要求 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 鸡病毒性关节炎　Aianviralarthritis 由禽呼肠孤病毒感染引起的鸡或火鸡的一种重要传染病. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. ARV:禽呼肠孤病毒(AvianReovirus) CEF:鸡胚成纤维细胞(ChickenEmbryonicFibroblasts) CPE:细胞病变效应(CytopathicEffect) ELISA:酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay) MEM:基础Eagle培养基(MinimalEagle’sMedium) PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline) RTＧPCR:反转录Ｇ聚合酶链式反应(ReverseTranscriptionＧpolymeraseChainReaction) RealＧtimeRTＧPCR:实时荧光反转录聚合酶链式反应(RealＧtimeReverseTranscriptionＧpolymerase ChainReaction) SPF:无特定病原(SpecificPathogenFree) TAE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ乙酸Ｇ乙二胺四乙酸(TrihydroxymethylAminomethaneＧaceticAcidＧethylＧ enediaminetetraAceticAcid) TMB:３,３′,５,５′Ｇ四甲基联苯胺(３,３′,５,５′ＧTetramethylＧBenzidine) ５　临床诊断 ５􀆰１　流行病学 ５􀆰１􀆰１　该病一年四季均可发生. ５􀆰１􀆰２　不同品种的鸡均可感染,但肉用型或肉蛋兼用型等体型较大的鸡多发. ５􀆰１􀆰３　不同日龄的鸡均可感染. ５􀆰１􀆰４　发病率高,死亡率较低,日龄越小越易感.雏鸡感染后,发病率和死亡率显著高于青年鸡和成年 １NY/T５４０—２０２３ 鸡.日龄大的鸡感染后潜伏期较长,有的可耐过. ５􀆰１􀆰５　该病可垂直传播,也可水平传播. ５􀆰２　临床症状 ５􀆰２􀆰１　病鸡精神沉郁,食欲减退,卧地倦动. ５􀆰２􀆰２　跗关节肿胀,腿变形,站立困难,跛行或单腿跳跃,严重病例瘫痪. ５􀆰２􀆰３　生长停滞、贫血、消瘦,日龄小的严重病例可逐渐衰竭死亡. ５􀆰３　病理变化 ５􀆰３􀆰１　剖检变化 ５􀆰３􀆰１􀆰１　跗关节和跖关节的剑鞘水肿,病鸡关节腔内有淡黄或淡红色渗出液,病程后期逐渐形成纤维素 性渗出. ５􀆰３􀆰１􀆰２　腿骨质脆,易折断. ５􀆰３􀆰１􀆰３　肌腱断裂. ５􀆰３􀆰２　组织学病变 ５􀆰３􀆰２􀆰１　在急性期,出现水肿、凝固性坏死,异嗜细胞集聚血管周围浸润,网状细胞增生,最后引起腱鞘壁 层明显增厚,滑膜腔充满异嗜细胞和脱落的滑膜细胞,随着破骨细胞增生而形成骨膜炎. ５􀆰３􀆰２􀆰２　在慢性期,滑膜形成绒毛样突起,并有淋巴样结节,大量纤维组织增生,明显见到网状细胞、淋巴 细胞、巨噬细胞和浆细胞的浸润或增生.趾关节和跗关节区也出现相同的一般炎症反应. ５􀆰４　结果判定 当鸡符合５􀆰１且符合５􀆰２、５􀆰３之一的,可判定为疑似鸡病毒性关节炎. ６　样品采集和处理 ６􀆰１　器材 ６􀆰１􀆰１　手术剪刀和镊子. ６􀆰１􀆰２　离心管. ６􀆰１􀆰３　样品保存管. ６􀆰１􀆰４　组织匀浆器. ６􀆰１􀆰５　采血器. ６􀆰１􀆰６　滤器(孔径０􀆰２２μm). ６􀆰２　试剂 ６􀆰２􀆰１　０􀆰０１mol/LpH７􀆰２PBS,配方应符合附录A中A􀆰１的规定. ６􀆰２􀆰２　青霉素(４０００IU/mL). ６􀆰２􀆰３　链霉素(４μg/mL). ６􀆰３　样品采集 ６􀆰３􀆰１　生物安全措施 实验室生物安全措施按照GB１９４８９的规定执行. ６􀆰３􀆰２　组织病料采集 ６􀆰３􀆰２􀆰１　活禽采样:灭菌棉拭子插入泄殖腔旋转２圈~３圈后,放入含青霉素４０００IU/mL和链霉素 ４μg/mL的无菌PBS样品保存管中. ６􀆰３􀆰２􀆰２　病死禽采样:无菌采取肝脏、脾脏、肾脏等组织样品或者关节腔内容物样品,放入样品保存管中. ６􀆰３􀆰３　血清样品采集 经翅静脉采集鸡血液,每只应不少于１mL.无菌分离血清,装入２mL离心管中,密封后２℃~８℃ 冷藏或－２０℃冷冻保存. ２NY/T５４０—２０２３ ６􀆰４　样品处理 ６􀆰４􀆰１　拭子样品:经剧烈振荡后,１００００r/min离心１０min,取上清液,２℃~８℃冷藏或－２０℃冷冻 保存. ６􀆰４􀆰２　组织样品:无菌条件下将组织剪碎,按１∶４加入生理盐水(青霉素４０００IU/mL和链霉素４μg/ mL)后组织研磨器制成匀浆,反复冻融２次~３次,１００００r/min离心１０min,取上清液,用直径０􀆰２２μm 滤器过滤除菌,２℃~８℃冷藏或－２０℃冷冻保存. ７　病毒分离与鉴定 ７􀆰１　器材 ７􀆰１􀆰１　冰箱(２℃~８℃、－２０℃、－７０℃不同温度). ７􀆰１􀆰２　恒温孵化箱. ７􀆰１􀆰３　离心机. ７􀆰１􀆰４　２５cm２细胞培养瓶. ７􀆰１􀆰５　倒置生物显微镜. ７􀆰２　试剂 ７􀆰２􀆰１　０􀆰０１mol/LPBS(pH７􀆰２),配方按照A􀆰１的规定执行. ７􀆰２􀆰２　细胞培养液,配方按照A􀆰２的规定执行. ７􀆰２􀆰３　细胞