2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 饲 料 中 6 种 雷 琐 酸 内 酯 类 化 合 物 的 测 定 气 相 色 谱 - 质 谱 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 6 8 1 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f s i x r e s o r c y l i c a c i d l a c t o n e s i n f e e d s — G a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 农 业 部 1 4 8 6 号 公 告 — 6 — 2 0 1 0NY/T４６８１—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 本文件代替农业部１４８６号公告—６—２０１０«饲料中雷琐酸内酯类化合物的测定　气相色谱质谱法», 与农业部１４８６号公告—６—２０１０相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: 农业部１４８６号公告—６—２０１０相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　更改了范围(见第１章,农业部１４８６号公告—６—２０１０的第１章); b)　增加了免疫亲和净化(见第４章); c)　增加了资料性附录(见附录A). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:中国农业大学. 本文件主要起草人:陈义强、程林丽、罗荪琳、刘颖、蒋慧. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２０１０年首次发布的为农业部１４８６号公告—６—２０１０; ———本次为第一次修订. ⅠNY/T４６８１—２０２５ 饲料中６种雷琐酸内酯类化合物的测定　气相色谱质谱法 １　范围 本文件描述了饲料中６种雷琐酸内酯类化合物的气相色谱质谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中玉米赤霉酮、αＧ玉米赤霉醇、βＧ 玉米赤霉醇、玉米赤霉烯酮、αＧ玉米赤霉烯醇和βＧ玉米赤霉烯醇的测定. 本文件６种雷琐酸内酯类化合物的检测限为２􀆰０μg/kg,定量限为５􀆰０μg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　免疫亲和净化气相色谱质谱法(方法一) ４􀆰１　原理 试样中的待测物用乙腈溶液提取,经免疫亲和柱净化,衍生化后用气相色谱质谱联用仪检测,基质匹 配标准溶液校准,外标法定量. ４􀆰２　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ４􀆰２􀆰１　水:GB/T６６８２规定的一级水. ４􀆰２􀆰２　甲醇:色谱级. ４􀆰２􀆰３　乙腈:色谱级. ４􀆰２􀆰４　甲苯:色谱级. ４􀆰２􀆰５　乙腈溶液:准确量取８０mL乙腈(４􀆰２􀆰３)和２０mL水,混匀. ４􀆰２􀆰６　磷酸盐缓冲液(pH７􀆰０):称取８􀆰０g氯化钠、１􀆰４４g磷酸氢二钠、０􀆰２４g磷酸二氢钾、０􀆰２g氯化 钾,用８００mL纯水溶解,然后用浓盐酸调节pH至７􀆰０,用水定容至１０００mL,混匀. ４􀆰２􀆰７　衍生化试剂:N,OＧ双三甲基硅烷基三氟乙酸胺(BSTFA)＋三甲基氯硅烷(TMCS)＝９９＋１. ４􀆰２􀆰８　混合标准储备溶液(１００μg/mL):准确称取玉米赤霉酮、αＧ玉米赤霉醇、βＧ玉米赤霉醇、αＧ玉米赤霉 烯醇、βＧ玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮各１０mg(精确至０􀆰０１mg),分别用甲醇(４􀆰２􀆰２)溶解,定量转移至 同一１００mL容量瓶中,用甲醇定容.标准品信息见附录A,混合标准储备溶液于－１８℃以下保存,有效 期３个月. ４􀆰２􀆰９　混合标准中间液(５μg/mL):准确移取混合标准储备溶液(４􀆰２􀆰８)１mL于２０mL容量瓶中,用甲 醇稀释、定容,混匀.２℃~８℃保存,有效期１个月. ４􀆰２􀆰１０　混合标准系列溶液:准确移取混合标准中间溶液(４􀆰２􀆰９)适量,用甲醇稀释成２ng/mL、 １０ng/mL、２０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、５００ng/mL和１０００ng/mL的混合标准系列溶液.２℃~ ８℃保存,有效期１周. １NY/T４６８１—２０２５ ４􀆰２􀆰１１　玉米赤霉烯酮免疫亲和柱:柱容量为１５００ng. ４􀆰３　仪器设备 ４􀆰３􀆰１　气相色谱质谱联用仪:配电子轰击离子源(EI). ４􀆰３􀆰２　天平:精度０􀆰０１g和０􀆰０１mg. ４􀆰３􀆰３　pH计:精度±０􀆰１. ４􀆰３􀆰４　涡旋混合器. ４􀆰３􀆰５　电热恒温干燥箱:精度±２℃. ４􀆰３􀆰６　振荡仪. ４􀆰３􀆰７　离心机,转速不低于８０００r/min. ４􀆰３􀆰８　氮吹仪. ４􀆰３􀆰９　固相萃取装置. ４􀆰４　样品 按GB/T２０１９５制备样品,至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm孔径的分析筛,充分混匀,装入 密闭容器中,备用.选取与待测样品类型相同,均匀一致,且在待测物保留时间处仪器响应值小于方法定 量限３０％的饲料样品,作为基质空白样品. ４􀆰５　测定步骤 ４􀆰５􀆰１　提取 平行做两份试验.准确称取５g(精确至０􀆰０１g)试样于５０mL离心管中,加入１g氯化钠,准确加入 ２０mL乙腈溶液(４􀆰２􀆰５),２００r/min振荡３０min,８０００r/min离心１０min,准确移取２mL上清液,加入 ２８mL磷酸盐缓冲液(４􀆰２􀆰６),混匀,备用. ４􀆰５􀆰２　净化 将备用液(４􀆰５􀆰１)全部过免疫亲和柱(４􀆰２􀆰１１),控制流速１滴/s~２滴/s,待溶液全部流出后,用 １０mL水淋洗亲和柱,弃去全部流出液.准确加入３mL甲醇(４􀆰２􀆰２)洗脱,流速约为１滴/s,收集洗脱液 于５mL具塞玻璃试管中,５０℃下氮气吹干,待衍生. ４􀆰５􀆰３　衍生化 将２００μL衍生化试剂(４􀆰２􀆰７)加入具塞玻璃试管(４􀆰５􀆰２),涡旋混合,密封,６０℃衍生１５min,冷却至 室温后,准确加入８００μL甲苯(４􀆰２􀆰４)混匀,待测. ４􀆰５􀆰４　基质匹配标准系列溶液的制备 称取７份基质空白试样各５g(精确至０􀆰０１g)于５０mL离心管中,按４􀆰５􀆰１和４􀆰５􀆰２处理.分别加 入混合标准系列溶液(４􀆰２􀆰１０)１mL溶解残渣,涡旋混合,配制成质量浓度分别为２ng/mL、１０ng/mL、 ２０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、５００ng/mL和１０００ng/mL的基质匹配标准系列溶液,现配现用. ５０℃氮气吹干,按４􀆰５􀆰３衍生,待测. ４􀆰５􀆰５　测定 ４􀆰５􀆰５􀆰１　气相色谱参考条件 气相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:DBＧ５MS毛细管柱,长度:３０m,内径:０􀆰２５mm,膜厚:０􀆰２５μm,或性能相当者; b)　载气:氦气; c)　载气流速:１􀆰０mL/min; d)　进样口温度:２５０℃; e)　进样方式:不分流; f)　进样量:２μL; g)　升温程序:初始温度１２０℃,以１５℃/min速度升至２８０℃,保持５􀆰２min. ４􀆰５􀆰５􀆰２　质谱参考条件 ２NY/T４６８１—２０２５ 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电子轰击电离(EI); b)　电子轰击能:７０eV; c)　离子源温度:２３０℃; d)　四级杆温度:１５０℃; e)　传输线温度:２５０℃; f)　溶剂延迟:５min; g)　采集方式:选择离子检测(SIM),间隔０􀆰３sec. ６种待测物的定性离子和定量离子见表１. 表１　６种待测物的定性离子和定量离子 待测物名称 定性离子(m/z) 定量离子(m/z) 玉米赤霉酮 ４４９,４５０,３３５,３０７ ３０７ αＧ玉米赤霉醇 ５２３,４３３,３３５,３０７ ３０７ βＧ玉米赤霉醇 ５２３,４３３,３３５,３０７ ３０７ 玉米赤霉烯酮 ４６２,４２９,３３３,３０５ ３３３ αＧ玉米赤霉烯醇 ５３６,４３１,３３３,３０５ ３０５ βＧ玉米赤霉烯醇 ５３６,４３１,３３３,３０５ ３０５ ４􀆰５􀆰５􀆰３　基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配标准系列溶液(４􀆰５􀆰４)和试样溶液(４􀆰５􀆰３)上机测定.基质匹 配标准系列溶液中６种待测物的定量离子色谱图见附录B. ４􀆰５􀆰５􀆰４　定性 在相同试验条件下,试样中待测物的保留时间与基质匹配标准溶液(质量浓度相当)相应组分的保留 时间一致,其相对偏差在１％之内,且试样中待测物定性离子的相对离子丰度与质量浓度接近的基质匹配 标准溶液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较,若偏差不超过表２规定的范围,则可判定为样品中 存在对应的待测物. 表２　定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度,％ ＞５０ ＞２０~５０ ＞１０~２０ ≤１０ 最大允许偏差,％ ±２０ ±２５ ±３０ ±５０ ４􀆰５􀆰５􀆰５　定量 以基质匹配标准溶液的质量浓