2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 犬 瘟 热 病 毒 、 犬 细 小 病 毒 检 测 二 重 荧 光 P C R 法 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 4 6 6 7 — 2 0 2 5 M e t h o d o f d u p l e x r e a l - t i m e P C R f o r d e t e c t i o n o f c a n i n e d i s t e m p e r v i r u s a n d c a n i n e p a r v o v i r u s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６６７—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国伴侣动物(宠物)标准化技术委员会(SAC/TC５４１)归口. 本文件起草单位:上海市动物疫病预防控制中心. 本文件主要起草人:赵洪进、鞠厚斌、杨德全、刘佩红、王建、周锦萍、吴秀娟、李鑫、沈海潇、葛菲菲、刘 健、李凯航、杨显超、王晓旭、邓波、卢军、葛杰、陶田谷晟. ⅠNY/T４６６７—２０２５ 犬瘟热病毒、犬细小病毒检测　二重荧光PCR法 １　范围 本文件规定了犬瘟热病毒和犬细小病毒二重荧光PCR检测方法的试剂和材料、仪器设备、样品的采 集与处理、操作方法、结果判定和检测要求. 本文件适用于犬的全血、组织(脑、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、肠系膜淋巴结等)、粪便、鼻拭子、眼分 泌物及细胞培养物犬瘟热病毒和犬细小病毒核酸的检测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 SN/T１１９３　基因检验实验室技术要求 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. 荧光PCR:荧光聚合酶链式反应(realＧtimepolymerasechainreaction) BHQ:无荧光淬灭基团(blackholequencher) CDV:犬瘟热病毒(caninedistempervirus) CPV:犬细小病毒(canineparvovirus) Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数(cyclethreshold) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) FAM:６Ｇ羧基荧光素(６Ｇcarboxyfluorescein) HEX:六氯Ｇ６Ｇ甲基荧光素(hexachlorofluorescein) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate) ５　试剂和材料 ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　总则:除特别说明外,本文件所用的试剂均为分析纯,实验室用水符合GB/T６６８２的要求.所有 试剂用无RNA酶污染的容器配制和分装. ５􀆰１􀆰２　Trizol:２℃~８℃保存. ５􀆰１􀆰３　三氯甲烷:２℃~８℃保存. １NY/T４６６７—２０２５ ５􀆰１􀆰４　７５％乙醇:用无水乙醇和DEPC水配制,－２０℃预冷. ５􀆰１􀆰５　异丙醇:－２０℃预冷. ５􀆰１􀆰６　AMV反转录酶(１０U/μL). ５􀆰１􀆰７　５×反转录反应预混液. ５􀆰１􀆰８　２×PCR反应预混液. ５􀆰１􀆰９　TaqDNA聚合酶(５U/μL). ５􀆰１􀆰１０　dNTP(２􀆰５mmol/L). ５􀆰１􀆰１１　RNase抑制剂(４０U/μL). ５􀆰１􀆰１２　蛋白酶K溶液(１０mg/mL):取１００mg蛋白酶K加入９􀆰５mL水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完 全溶解,加水定容到１０mL. ５􀆰１􀆰１３　１０％SDS:取１０gSDS溶于１００mL去离子水. ５􀆰１􀆰１４　PBS(０􀆰０１mmol/L,pH７􀆰４):磷酸氢二钠(Na２HPO４􀅰１２H２O)２９􀆰０２g,磷酸二氢钠 (NaH２PO４)２􀆰９６g,氯化钠(NaCl)８􀆰５０g,将上述试剂溶于１０００mL去离子水中,pH调至７􀆰４后,１２１℃ 高压灭菌２０min,４℃保存备用. ５􀆰１􀆰１５　DEPC水:将DEPC加入去离子水中至终浓度为０􀆰１％(体积比),充分混合均匀后作用１２h,分 装,１２１℃高压灭菌３０min,冷却后冷藏备用. ５􀆰２　引物与探针 二重荧光PCR扩增用上、下游引物和探针序列应符合附录A的规定. ６　仪器设备 ６􀆰１　多通道荧光PCR检测仪. ６􀆰２　恒温水浴锅. ６􀆰３　涡旋震荡仪. ６􀆰４　微量移液器:量程为０􀆰５μL~１０μL、２μL~２０μL、２０μL~２００μL和２００μL~１０００μL. ７　样品的采集与处理 ７􀆰１　样品的采集 ７􀆰１􀆰１　全血 压迫犬肘部使前臂头静脉怒张,绷紧头静脉两侧皮肤,采样针头斜面朝上、呈１５°角由远心端向近心 端刺入静脉血管,见有血液流出时,缓慢抽取１mL血液置于含０􀆰２mLEDTA的抗凝采血管中,并上下 颠倒不少于５次,充分混匀,４℃保存备用. ７􀆰１􀆰２　组织 病死犬可采集脑、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、肠系膜淋巴结等含毒量高的组织脏器.取１g组织样 品并加入２mL的PBS研磨匀浆,将组织匀浆液收集至无菌保存管中,４℃保存备用. ７􀆰１􀆰３　粪便 取１g粪便样品置于５mL的无菌保存管中,加入１mL的PBS后混匀,４℃保存备用. ７􀆰１􀆰４　鼻拭子 用无菌鼻拭子插入鼻腔内,轻轻擦拭并慢慢旋转至少３圈,将拭子置于装有１mLPBS的无菌保存管 中,４℃保存备用. ７􀆰１􀆰５　眼分泌物 用无菌拭子轻轻擦拭眼分泌物后,置于装有１mLPBS的无菌保存管中,４℃保存备用. ７􀆰２　样品的处理 ２NY/T４６６７—２０２５ ７􀆰２􀆰１　全血样品 血液混匀后,转入１􀆰５mL灭菌离心管中,直接用于核酸提取或４℃保存备用. ７􀆰２􀆰２　组织或粪便 将含有组织或粪便匀浆液无菌保存管在涡旋震荡仪上充分混合后,在４℃下１２０００g离心５min,取 上清液,转入１􀆰５mL离心管中,４℃保存备用. ７􀆰２􀆰３　拭子 将含有鼻拭子或眼分泌物拭子无菌保存管在涡旋震荡仪上充分混合后,在４℃下３０００g离心５min 取上清液,转入１􀆰５mL离心管中,４℃保存备用. ７􀆰２􀆰４　细胞培养物 取培养物反复冻融３次,分装到１􀆰５mL离心管中,４０００g离心１min,取上清液待检.如果不能及 时检测,则应－２０℃保存备用. ８　操作方法 ８􀆰１　样品RNA提取及反转录 ８􀆰１􀆰１　在样本制备区进行. ８􀆰１􀆰２　样品RNA提取及反转录接附录B中B􀆰１的规定执行. ８􀆰２　样品DNA提取 ８􀆰２􀆰１　在样本制备区进行. ８􀆰２􀆰２　样品DNA提取按B􀆰２的规定执行. ８􀆰３　扩增试剂的准备与配制 ８􀆰３􀆰１　在试剂储存和准备区进行. ８􀆰３􀆰２　二重荧光PCR反应体系.每个检测反应体系需要１９μL荧光PCR反应液,具体为２×PCR反应 预混液１２􀆰５μL,ExTaq(５U/μL)０􀆰５μL,上、下游引物P１、P２、P３、P４(２０pmol/μL)各０􀆰８μL,探针 P５、P６(２０pmol/μL)各０􀆰６μL,DEPC水１􀆰６μL,混合均匀. 同时设置阳性对照(取CDV、CPV细胞培养物的RNA反转录产物或DNA为模板)、阴性对照(不含 CDV、CPV细胞培养物的RNA反转录产物或DNA模板)和空白对照(DEPC水,在扩增反应阶段设置). ８􀆰４　加样 ８􀆰４􀆰１　在样本制备区进行. ８􀆰４􀆰２　在８􀆰３􀆰２的反应管中分别加入８􀆰１􀆰２中制备的RNA反转录产物和８􀆰２􀆰２中制备的DNA溶液各 ３μL,使每管总体积达到２５μL,记录反应管对应的样品编号.盖紧管盖后,５００g离心３０s.转移至扩增 区. ８􀆰５　荧光PCR反应 ８􀆰５􀆰１　在扩增区进行. ８􀆰５􀆰２　将８􀆰４􀆰２中加样后的反应管放入荧光PCR检测仪中,设置探针:报告基团选择FAM和HEX两 个荧光通道,淬灭基团均选择无(None)荧光.在荧光PCR仪上进行以下反应:９５℃５min;９５℃５s, ６０℃３５s,在每个循环第二步(６０℃３５s)收集荧光信号,共４０个循环. ９　结果判定 ９􀆰１　阈值设定 阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点.不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整. ９􀆰２　质量控制 阳性对照均有对数扩增曲线,且Ct值≤３０;阴性对照没有对数扩增曲线,且无Ct值,二者均成立可判 定试验成立,否则试验无效. ３NY/T４６６７—２０２５ ９􀆰３　结果描述及判定 ９􀆰３􀆰１　阴性 无Ct值且无典型的扩增曲线,表明犬瘟热病毒或犬细小病