2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 犬 精 液 品 质 检 测 技 术 规 范 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 3 0 C C S B 4 6 6 5 — 2 0 2 5 T e c h n i c a l s p e c i f i c a t i o n f o r q u a l i t y d e t e c t i o n o f c a n i n e s e m e n Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６６５—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国伴侣动物(宠物)标准化技术委员会(SAC/TC５４１)归口. 本文件起草单位:公安部南昌警犬基地、北京市动物疫病预防控制中心、北京市小动物诊疗行业协会、 北京市标准化研究院、公安部昆明警犬基地、中国人民武装警察部队军犬基地. 本文件主要起草人:吴衍、余盼、熊前、叶俊华、李川武、韦海涛、刘朗、谢翔燕、项茹雪、万九生、刘成功、 王春亮、李涛. ⅠNY/T４６６５—２０２５ 　 　 　犬精液品质检测技术规范 １　范围 本文件规定了犬精液的质量要求、外观检查、采精量检查、精子密度检查、精子活力检查和精子畸形率 检查. 本文件适用于犬精液品质的实验室检测. ２　规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件. ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 精液　semen 公犬射精时由尿生殖道排出的分泌物,由精子和精清两部分组成. ３􀆰２ 采精量　ejaculatevolume 单只公犬一次射精时排出的第二段精液体积. ３􀆰３ 精子密度　spermconcentration 单位体积精液中的精子数目. ３􀆰４ 精子活力　spermmotility 在３７℃下前进运动精子数占总精子数的百分率. ３􀆰５ 精子畸形率　abnormalspermpercentage 畸形精子数占总精子数的百分率. ４　质量要求 犬精液质量应符合表１的要求. 表１　精液质量要求 项目 指标 外观 颜色应呈乳白色,无异常分泌物,无皮毛等异物 采精量,mL ≥０􀆰５ 精子密度,个/mL ≥０􀆰５×１０８ 精子活力,％ ≥７０ 精子畸形率,％ ≤２０ ５　检测方法 ５􀆰１　外观检查 可采用目测法对精液外观进行检查. １NY/T４６６５—２０２５ ５􀆰２　采精量检查 ５􀆰２􀆰１　主要器材 刻度试管,精度为０􀆰１mL,量程为５mL~１０mL. ５􀆰２􀆰２　检查方法 采集公犬射出的第二段精液,用刻度试管测量精液量. ５􀆰３　精子密度检查 ５􀆰３􀆰１　主要器材 血细胞计数板、移液器、小试管、计数器、显微镜或电视显微装置、滴管、３􀆰０％氯化钠溶液. ５􀆰３􀆰２　检查方法 采用血细胞计数板法检查.具体操作要求和步骤如下: a)　用移液器准确吸取２０μL样品,使用３􀆰０％氯化钠溶液０􀆰３８mL与其混合均匀,使之成为２０倍 稀释的稀释精液; b)　将备好的血细胞计数板用血盖片将计数室盖好,用小吸管吸取１滴稀释精液滴于血盖片边缘,使 之自行流入计数室,均匀充满,不宜有气泡或厚度过大; c)　将制好的样品在２００倍~４００倍显微镜下观察计数. ５􀆰３􀆰３　计算 精液密度按公式(１)计算.每样品应观察上、下两个计数室,取平均值.如两个计数室计数结果误差 超过５％,则应重检. 精子密度＝５N×５(即计数室２５个中方格的总精子数)×１０(１mm３内的精子数)× １０００(每毫升精液的精子数)×２０(稀释倍数) (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 公式(１)可简化为公式(２). ρ＝N×１０６(２) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: ρ———精子密度,单位为１０８个/mL,计算结果保留至小数点后２位; N———５个中方格的精子数,单位为个. ５􀆰４　精子活力检查 ５􀆰４􀆰１　主要器材 显微镜或显微电脑装置、恒温水浴箱、试管、载玻片、盖玻片、显微镜保温箱或恒温装置、移液器等. ５􀆰４􀆰２　检查方法 检测要求及操作步骤如下: a)　取约１０μL精液(冻精直接置于３７℃水浴中解冻后取样)置于载玻片上加盖玻片,每个试样制备 ２个样片; b)　立即在载物台温度保持３７℃的情况下用２００倍~４００倍显微镜观察活力,也可通过显微电脑装 置在荧光屏上观察活力; c)　每样片观察３个视野,并应观察不同液层精子的运动状态,进行全面评定. ５􀆰４􀆰３　计算 按公式(３)计算精子活力. M＝n１＋n２ ２(３) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: M———精子活力,单位为百分号(％),计算结果保留至小数点后２位; n１———第一样片精子活力的数值,单位为百分号(％); n２———第二样片精子活力的数值,单位为百分号(％). ５􀆰５　精子畸形率检查 ２NY/T４６６５—２０２５ ５􀆰５􀆰１　主要器材 显微镜、载玻片、血细胞分类计数器、小吸管、蒸馏水、吉姆萨染液、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醛、甲 醇、甘油,所用试剂均为AR级. ５􀆰５􀆰２　溶液配制 实验所需溶液配制要求应符合附录A的要求. ５􀆰５􀆰３　制片 允许同时使用精子活力检查样品. a)　抹片:取精液１滴,滴于载玻片一端,用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈３５°夹角,将 样品均匀地拖布于载玻片上,自然风干(约５min),每样品制作２个抹片; b)　固定:在已风干的抹片上滴１􀆰０mL~２􀆰０mL中性福尔马林固定液,固定１５min后用清水缓缓 冲去固定液,吹干或自然风干. ５􀆰５􀆰４　染色 将固定好后抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上,将吉姆萨染液滴于槽和抹片之间,让其充满平槽并 使抹片接触染液,约１􀆰５h后用清水缓缓冲去染液,晾干待检. ５􀆰５􀆰５　镜检 将制备好的抹片在显微镜(４００倍~６００倍)下观察,每个抹片观察２００个以上的精子(分左、右两个 区),取两片的平均值,两片的变异系数不得大于２０％,若超过应重新制片. ５􀆰５􀆰６　计算 精子畸形率应按公式(４)计算. A＝A１ S×１００ (４) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: A———精子畸形率,单位为百分号(％),计算结果保留至小数点后２位; A１———畸形精子数,单位为个; S———精子总数,单位为个. ３NY/T４６６５—２０２５ 附　录　A (规范性) 精子畸形率检查实验溶液配制 A􀆰１　磷酸盐缓冲液 磷酸二氢钠(NaH２PO４􀅰２H２O)　　　　　　　０􀆰５５g 磷酸氢二钠(Na２HPO４􀅰１２H２O)　　　　　　２􀆰２５g 双蒸馏水定容至１００mL. A􀆰２　中性福尔马林固定液 ４０％甲醛(HCHO,使用前经碳酸镁中和过滤)　８􀆰０mL 磷酸二氢钠(NaH２PO４􀅰２H２O) ０􀆰５５g 磷酸氢二钠(Na２HPO４􀅰１２H２O)　 ２􀆰２５g 用０􀆰８９％氯化钠约５０􀆰０mL溶解后加入８􀆰０mL中和后的甲醛,再加０􀆰８９％氯化钠溶液定容至１００mL. A􀆰３　吉姆萨原液 吉姆萨染料　　　　 １􀆰０g 甘油[C３H５(OH)３]　 ６６􀆰０mL 甲醇(CH３OH)　 ６６􀆰０mL 吉姆萨染料放入研钵中加少量甘油充分研磨直至无颗粒,然后将甘油全部倒入并放入恒温培养箱中 保温继续溶解４h,再加甲醇充分溶解混匀,过滤后储存于棕色瓶中待用.储存时间越久,染色效果越好. A􀆰４　吉姆萨染液 吉姆萨原液　　　　　　　 ２􀆰０mL 磷酸盐缓冲液　　　　　　 ３􀆰０mL 蒸馏水　　　　　　　　 ５􀆰０mL 现配现用. ４