2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 动 物 源 伪 结 核 棒 状 杆 菌 分 离 与 鉴 定 技 术 规 程 2 2 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 1 2 0 . 1 0 C C S X 4 6 5 7 — 2 0 2 5 T e c h n i c a l c o d e o f p r a c t i c e f o r i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f C o r y n e b a c t e r i u m p s e u d o t u b e r c u l o s i s f r o m a n i m a l s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６５７—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规则 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口. 本文件起草单位:西北农林科技大学、中国兽医药品监察所. 本文件主要起草人:杨增岐、王娟、王斌、程敏、赵光明、张纯萍、魏宇辰、王晨骁、赵琪、王鹤佳、徐士新、 李霆、崔明全. ⅠNY/T４６５７—２０２５ 动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术规程 １　范围 本文件确立了伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)分离与鉴定流程,规定了试剂 或材料、仪器设备、样品采集与保存运输、分离纯化、筛查与鉴定、菌株保藏、生物安全要求的操作指示,描 述了相应的试验方法. 本文件适用于动物源细菌耐药性监测对动物脓肿样品中伪结核棒状杆菌的分离与鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB１９４８９　实验室生物安全通用要求 NY/T１９４８　兽医实验室生物安全要求通则 NY/T４１４１　动物源细菌耐药性监测样品采集技术规程 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　试剂或材料 ４􀆰１　要求 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T６６８２规定的三级水,培养基按附录A的规定 配制或用商品化产品. ４􀆰２　试剂 ４􀆰２􀆰１　氯化钠. ４􀆰２􀆰２　过氧化氢(３０％). ４􀆰２􀆰３　聚合酶链式反应预混液(２×PCRMasterMix). ４􀆰２􀆰４　琼脂糖. ４􀆰２􀆰５　乙醇:色谱纯. ４􀆰２􀆰６　甲酸:色谱纯. ４􀆰２􀆰７　乙腈:色谱纯. ４􀆰２􀆰８　αＧ氰Ｇ４Ｇ羟基肉硅酸(HCCA):色谱纯. ４􀆰２􀆰９　甘油. ４􀆰３　溶液制备 ４􀆰３􀆰１　３％过氧化氢溶液:取过氧化氢１００mL、水９００mL,混匀. ４􀆰３􀆰２　基质溶液:取HCCA,按说明书配制;或用市售商品. ４􀆰３􀆰３　灭菌甘油:取甘油适量,１２１℃灭菌２０min. ４􀆰３􀆰４　无菌生理盐水:取氯化钠８􀆰５g,溶于１０００mL水中,１２１℃高压灭菌２０min. ４􀆰３􀆰５　５％蔗糖脱脂乳保护剂:按照附录A中A􀆰１的规定执行. １NY/T４６５７—２０２５ ４􀆰３􀆰６　７５％乙醇:取乙醇７５mL,加水至１００mL. ４􀆰３􀆰７　７０％甲酸:取甲酸７０mL,加水至１００mL. ４􀆰４　培养基制备 ４􀆰４􀆰１　绵羊血琼脂(５％~１０％):按照A􀆰２的规定执行. ４􀆰４􀆰２　脑心浸出液(BHI)培养基:按照A􀆰３的规定执行. ４􀆰４􀆰３　小牛血清BHI琼脂(５％~１０％):按照A􀆰４的规定执行. ４􀆰５　标准菌株 伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)[ATCC１９４１０/CVCC１１８６]. ４􀆰６　材料 ４􀆰６􀆰１　革兰氏染色剂. ４􀆰６􀆰２　菌种冷冻保存管或磁珠保存管. ４􀆰６􀆰３　细菌DNA提取试剂盒. ４􀆰６􀆰４　棒状杆菌鉴定卡(盒)或同类产品. ５　仪器设备 ５􀆰１　二级生物安全柜. ５􀆰２　冰箱:２℃~８℃,－２０℃及以下. ５􀆰３　恒温培养箱. ５􀆰４　显微镜:１０×~１０００×. ５􀆰５　PCR仪. ５􀆰６　核酸电泳仪. ５􀆰７　电泳凝胶成像分析系统. ５􀆰８　分析天平:感量０􀆰０１g. ５􀆰９　高速冷冻离心机:离心速度≥１２０００r/min. ５􀆰１０　pH计. ５􀆰１１　麦氏浊度仪或标准麦氏比浊管. ５􀆰１２　微生物生化鉴定系统. ５􀆰１３　微生物质谱仪(MALDIＧTOFMS). ６　分离与鉴定流程 分离与鉴定流程见图１. ７　样品采集与保存运输 样品采集按照NY/T４１４１的规定执行.样品需在２℃~８℃条件下保存运输,无BHI肉汤的样品运 输时间不超过２４h,添加BHI肉汤的样品运输时间不超过４８h. ８　分离纯化 用接种环蘸取脓肿内容物划线接种绵羊血琼脂平板,３６℃(±１℃)培养２４h~４８h.挑取单个乳白 色、不透明、有βＧ溶血环、边缘整齐、干燥、易刮落的可疑菌落,接种绵羊血琼脂平板,纯化,备用. ９　筛查与鉴定 ９􀆰１　筛查 ２NY/T４６５７—２０２５ 图１　伪结核棒状杆菌分离与鉴定流程 ９􀆰１􀆰１　形态学检查 取纯化菌落,染色,镜检.应为蓝紫色,呈球状、短杆状或棒状,无芽孢,无荚膜. ９􀆰１􀆰２　触酶试验 取纯化菌落,置于载玻片上,加３％过氧化氢溶液１滴,应立即产生气泡(触酶试验阳性). ９􀆰２　鉴定 ９􀆰２􀆰１　通则 生化鉴定、PCR鉴定和质谱鉴定３种方法任选其一. ９􀆰２􀆰２　生化鉴定 将触酶试验阳性的菌株,接种绵羊血琼脂平板,３６℃(±１℃)培养２４h~４８h.用麦氏比浊仪或标准 麦氏比浊管调整浊度为０􀆰５麦氏单位.用微生物生化鉴定系统或棒状杆菌鉴定卡(盒)进行鉴定.伪结核 棒状杆菌生化鉴定表见附录B中的表B􀆰１. ９􀆰２􀆰３　PCR鉴定 ９􀆰２􀆰３􀆰１　模板制备 取新鲜纯化菌落,用细菌DNA提取试剂盒提取DNA作为模板,备用.伪结核棒状杆菌标准菌株作 为阳性对照,水为阴性对照. ９􀆰２􀆰３􀆰２　引物 引物序列及扩增片段长度见表１. 表１　伪结核棒状杆菌的PCR引物序列及扩增片段长度 细菌 引物序列 扩增片段长度,bp 伪结核棒状杆菌上游引物(１６SrRNAＧF):５′ＧAGTTTGATCCTGGCTCAGＧ３′ 下游引物(１６SrRNAＧR):５′ＧAGGCCCGGGAACGTATTCACＧ３′１３５６ ９􀆰２􀆰３􀆰３　PCR扩增 PCR反应体系(２０μL)见表２. ３NY/T４６５７—２０２５ 表２　PCR反应体系 试剂 体积,μL ２×PCRMasterMix １０ 上游引物(１０μmol/L) １ 下游引物(１０μmol/L) １ 水(ddH２O) ６ 模板 ２ ９􀆰２􀆰３􀆰４　反应条件 ９４℃预变性５min;９４℃变性３０s,５５℃退火３０s,７２℃延伸５０s,３５个循环;７２℃终延伸５min, ４℃保存. ９􀆰２􀆰３􀆰５　电泳 取PCR扩增产物,于１％~２％的琼脂糖凝胶中电泳,用凝胶成像分析系统观察. ９􀆰２􀆰３􀆰６　结果判定 扩增条带大小符合１３５６bp的为阳性.阳性扩增产物需测序比对鉴定,相似度不低于９９％.PCR产 物大小和测序结果见B􀆰２和B􀆰３. ９􀆰２􀆰４　质谱鉴定 ９􀆰２􀆰４􀆰１　菌样制备 取新鲜纯化菌落,用７５％乙醇重悬,１２０００r/min离心２min,弃上清,加入７０％甲酸溶液５０μL,混 匀.再加乙腈５０μL,混匀,１２０００r/min离心２min.取上清液１μL加入靶板样品孔中,晾干,加HCCA 基质溶液１μL,混匀,晾干.或按微生物质谱仪推荐方法操作.标准菌株的新鲜菌落同法操作. ９􀆰２􀆰４􀆰２　仪器校准 检测样品前,应对微生物质谱仪进行校准. ９􀆰２􀆰４􀆰３　测定 取制备好的样品靶板,置于质谱仪靶板槽中.编辑样品信息后,进行谱图的数据采集. ９􀆰２􀆰４􀆰４　结果判定 微生物质谱仪自动完成谱图的比对和鉴定.以不同分值显示结果,鉴定分值达到种水平可信即可. 伪结核棒状杆菌标准菌株质谱图见附录C. １０　菌株保藏 将已鉴定的菌株接种于小牛血清的BHI琼脂培养基,培养至对数生长期.取新鲜菌,加无菌生理盐 水制成菌悬液,与灭菌甘油溶液混合,使甘油终浓度为２０％~４０％;或加入磁珠保藏管;或加５％蔗糖脱脂 乳保护剂,冻干.－２０℃或以下保藏. １１　生物安全要求 实验室设施设备、人员防护及实验的安全操作、实验废弃物和菌种的处理应符合GB１９４８９和NY/T１９８９ 的要求. ４NY/T４６５７—２０２５ 附　录　A (规范性) 培养基与试剂 A􀆰１　５％蔗糖脱脂乳保护剂 A􀆰１􀆰１　成分 脱脂乳　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０􀆰０g 蔗糖 ５􀆰０g 水 １００mL A􀆰１􀆰２　制法 将A􀆰１􀆰１中各成分,混合,１１２℃灭菌２０min,备用. A􀆰２　绵羊血琼脂(５％~１０％) A􀆰２􀆰１　成分 蛋白胨 １０􀆰０g 牛肉浸出粉 ３􀆰０g 氯化钠　 ５􀆰０g 琼脂　 １５􀆰０g 水　　 １０００mL 绵羊抗凝血 ５０mL~１００mL A􀆰２􀆰２　制