2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 动 物 源 产 气 荚 膜 梭 菌 分 离 与 鉴 定 技 术 规 程 2 2 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 1 2 0 . 1 0 C C S X 4 6 5 6 — 2 0 2 5 T e c h n i c a l c o d e o f p r a c t i c e f o r i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s f r o m a n i m a l s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６５６—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口. 本文件起草单位:中国农业大学、中国兽医药品监察所. 本文件起草人:王少林、赵琪、吴聪明、张纯萍、张仕泓、王鹤佳、周宇晴、徐士新、陈安杰、崔明全、李霆、 程敏. ⅠNY/T４６５６—２０２５ 动物源产气荚膜梭菌分离与鉴定技术规程 １　范围 本文件确立了动物源产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)分离与鉴定的程序,规定了样品采集 与保存运输、分离纯化、筛查与鉴定、菌种保藏、生物安全要求的操作指示,描述了相应的试验方法. 本文件适用于动物源细菌耐药性监测对动物直肠/泄殖腔拭子、新鲜粪便、肠道内容物等样品中产气 荚膜梭菌的分离和鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该 日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB４７８９􀆰１３　食品安全标准　食品微生物学检验　产气荚膜梭菌检验 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB１９４８９　实验室生物安全通用要求 NY/T１９４８　兽医实验室生物安全要求通则 NY/T４１４１　动物源细菌耐药性监测样品采集技术规程 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　试剂或材料 ４􀆰１　要求 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T６６８２规定的三级水,培养基按附录A配制或 用商品化产品. ４􀆰２　试剂 ４􀆰２􀆰１　灭菌液体石蜡. ４􀆰２􀆰２　PCR预混液(２×PCRMasterMix). ４􀆰２􀆰３　５０×TAE缓冲液. ４􀆰２􀆰４　琼脂糖. ４􀆰２􀆰５　DNAMarker(２０００bp). ４􀆰２􀆰６　αＧ氰Ｇ４Ｇ羟基肉硅酸(HCCA). ４􀆰２􀆰７　甘油. ４􀆰３　溶液制备 ４􀆰３􀆰１　１×TAE缓冲液:取５０×TAE缓冲液２０mL,加水至１０００mL. ４􀆰３􀆰２　１％琼脂糖凝胶:取琼脂糖１􀆰０g,于１００mL１×TAE中加热,充分溶解. ４􀆰３􀆰３　基质溶液:取αＧ氰Ｇ４Ｇ羟基肉硅酸(HCCA),按说明书配制,或用市售商品. ４􀆰３􀆰４　灭菌甘油:取甘油适量,１２１℃高压灭菌２０min. ４􀆰４　培养基制备 ４􀆰４􀆰１　Amies运送培养基:按照附录A中A􀆰１的规定执行. ４􀆰４􀆰２　液体硫乙醇酸盐培养基(FTG):按照A􀆰２的规定执行. １NY/T４６５６—２０２５ ４􀆰４􀆰３　胰胨Ｇ亚硫酸盐Ｇ环丝氨酸琼脂培养基(TSC):按照A􀆰３的规定执行. ４􀆰４􀆰４　５％绵羊血琼脂培养基:按照A􀆰４的规定执行. ４􀆰４􀆰５　５％蔗糖脱脂乳保护剂:按照A􀆰５的规定执行. ４􀆰５　标准菌株 产气荚膜梭菌毒素C型(Clostridiumperfringens,TypeC)[CVCC６０１０１]. ４􀆰６　材料 ４􀆰６􀆰１　无菌脱纤维绵羊血. ４􀆰６􀆰２　生化鉴定试剂盒或鉴定卡. ４􀆰６􀆰３　细菌DNA提取试剂盒. ４􀆰６􀆰４　磁珠保藏管. ５　仪器设备 ５􀆰１　二级生物安全柜. ５􀆰２　冰箱:２℃~８℃,－２０℃或以下. ５􀆰３　分析天平:感量０􀆰０１g. ５􀆰４　精密天平:感量０􀆰００１g. ５􀆰５　移液器:０􀆰５μL~１０００μL. ５􀆰６　恒温培养箱. ５􀆰７　厌氧培养装置. ５􀆰８　微生物生化鉴定系统. ５􀆰９　PCR仪. ５􀆰１０　高速冷冻离心机:离心速度≥１２０００r/min. ５􀆰１１　核酸电泳仪. ５􀆰１２　电泳凝胶成像分析系统. ５􀆰１３　微生物质谱仪(MALDIＧTOFMS). ６　分离鉴定程序 分离与鉴定流程见图１. 图１　产气荚膜梭菌分离与鉴定流程 ２NY/T４６５６—２０２５ ７　样品采集与保存运输 按照NY/T４１４１的规定执行. ８　分离纯化 ８􀆰１　预增菌 ８􀆰１􀆰１　动物直肠/泄殖腔拭子 取样品液２００μL,置于FTG培养基２mL中,混匀,液体石蜡封固,３６℃(±１℃)厌氧培养２０h~ ２４h. ８􀆰１􀆰２　新鲜粪便、肠道内容物 取样品适量,置于FTG培养基２mL中,混匀,液体石蜡封固,３６℃(±１℃)厌氧培养２０h~２４h. ８􀆰２　增菌 取预增菌液１mL、约５０℃的TSC琼脂培养基９mL,倾注平皿,缓慢旋转混匀,室温凝固.再加入约 ５０℃的TSC琼脂培养基１０mL,室温凝固,正置,３６℃(±１℃)厌氧培养２０h~２４h. ８􀆰３　纯化 挑取圆形黑色单菌落,接种５％绵羊血琼脂培养基,３６℃(±１℃)倒置厌氧培养２０h~２４h.挑取有 溶血环、表面光滑菌落,接种５％绵羊血琼脂培养基,３６℃(±１℃)倒置厌氧培养２０h~２４h,纯化, 备用.　 ９　筛查与鉴定 ９􀆰１　筛查 ９􀆰１􀆰１　形态学检查 取纯化菌落,按照GB４７８９􀆰１３的规定执行. ９􀆰２　鉴定 ９􀆰２􀆰１　通则 生化鉴定、PCR鉴定和质谱鉴定３种方法任选其一. ９􀆰２􀆰２　生化鉴定 按照GB４７８９􀆰１３的规定执行,也可以使用生化鉴定试剂盒、鉴定卡或微生物生化鉴定系统鉴定. ９􀆰２􀆰３　PCR鉴定 ９􀆰２􀆰３􀆰１　模板制备 取新鲜的纯化菌落,加灭菌水１mL,煮沸１０min,冰浴冷却,１２０００r/min离心３min.取上清液,备 用.或使用细菌DNA提取试剂盒提取DNA作为模板.产气荚膜梭菌标准菌株作为阳性对照,水为阴性 对照. ９􀆰２􀆰３􀆰２　引物 引物序列及扩增片段长度见表１. 表１　产气荚膜梭菌的PCR引物序列及扩增片段长度 细菌 引物序列 扩增片段长度,bp 产气荚膜梭菌上游引物(cpaＧF):５′ＧGCTAATGTTACTGCCGTTGAＧ３′ 下游引物(cpaＧR):５′ＧCCTCTGATACATCGTGTAAGＧ３′３２４ ９􀆰２􀆰３􀆰３　反应体系 反应体系(３０μL)见表２. ３NY/T４６５６—２０２５ 表２　PCR反应体系 试剂 体积,μL ２×PCRMasterMix １５ 上游引物(１０μmol/L) １ 下游引物(１０μmol/L) １ 水(ddH２O) １２ 模板 １ ９􀆰２􀆰３􀆰４　反应条件 ９４℃预变性５min;９４℃变性３０s,５５℃退火３０s,７２℃延伸３０s,３０个循环;７２℃延伸１０min. ９􀆰２􀆰３􀆰５　电泳 取PCR扩增产物,于１％的琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像分析. ９􀆰２􀆰３􀆰６　结果判定 扩增条带大小符合３２４bp的为阳性.阳性扩增产物必要时测序比对鉴定,相似度不低于９９％.产气 荚膜梭菌PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果和测序结果见附录B中B􀆰１和B􀆰２. ９􀆰２􀆰４　质谱鉴定 ９􀆰２􀆰４􀆰１　菌样制备 挑取单个新鲜纯化菌落,均匀涂布于靶板样品孔中,室温干燥.吸取１μL基质溶液滴于样品上,混 匀,室温干燥.标准菌株的新鲜菌落同法操作. ９􀆰２􀆰４􀆰２　仪器校准 检测样品前,应对微生物质谱仪进行校准. ９􀆰２􀆰４􀆰３　测定 取制备好的样品靶板,置于质谱仪靶板槽中.编辑样品信息后,进行谱图的数据采集. ９􀆰２􀆰４􀆰４　结果判定 微生物质谱仪自动完成谱图的比对和鉴定.以不同分值显示结果,鉴定分值达到种水平可信即可. 产气荚膜梭菌毒素C型标准菌株质谱鉴定谱图见附录C. １０　菌株保藏 取新鲜纯化菌,加入含有５％无菌脱纤维羊血的FTG培养基制成菌悬液,与灭菌甘油溶液混合,使甘 油终浓度为２０％~４０％;或加入磁珠保藏管;或加入５％蔗糖脱脂乳保护剂,冻干.－２０℃或以下保藏. １１　生物安全要求 实验室设施设备、人员防护及实验的安全操作、实验废弃物和菌种的处理应符合GB１９４８９和NY/T１９４８ 的要求. ４NY/T４６５６—２０２５ 附　录　A (规范性) 培　养　基 A􀆰１　Amies运送培养基 A􀆰１􀆰１　成分 氯化钠 ３􀆰０g 磷酸二氢钾 ０􀆰２g 磷酸氢二钠 １􀆰１５g 氯化钾 ０􀆰２g 氯化镁 ０􀆰１g 硫代乙醇酸钠 １􀆰０g 氯化钙 ０􀆰１g 琼脂 ７􀆰５g 水 １０００mL A􀆰１􀆰２　制法 将A􀆰１􀆰１中各成分加入水中,混匀,加热煮沸至完全溶解,调节pH至７􀆰３±０􀆰１,１２１℃高压灭菌 １５min,备用. A􀆰２　液体硫乙醇酸盐培养基(FTG) A􀆰２􀆰１　基础液 胰蛋白胨 １５􀆰０g LＧ胱氨酸 ０􀆰５g 酵母粉 ５􀆰０g 葡萄糖 ５􀆰０g 氯化钠 ２􀆰５g