2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 牛 乳 及 其 制 品 中 α - 乳 白 蛋 白 和 β - 乳 球 蛋 白 的 测 定 高 效 液 相 色 谱 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 1 0 0 C C S X 4 6 3 0 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f α - l a c t a l b u m i n a n d β - l a c t o g l o b u l i n i n m i l k a n d d a i r y p r o d u c t s — H i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６３０—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起 草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC２７４)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室 (北京)、农业农村部奶及奶制品质量检验测试中心(北京)、中优乳奶业研究院(天津)有限公司、唐山市食 品药品综合检验检测中心、内蒙古智慧质量中心有限公司、黑龙江飞鹤乳业有限公司. 本文件主要起草人:郑楠、刘慧敏、张宁、叶巧燕、陈岭军、周淑萍、屈雪寅、郭洪侠、张慧萍、王象欣. ⅠNY/T４６３０—２０２５ 牛乳及其制品中αＧ乳白蛋白和βＧ乳球蛋白的测定 高效液相色谱法 １　范围 本文件描述了牛乳及其制品中αＧ乳白蛋白和βＧ乳球蛋白测定的高效液相色谱方法. 本文件第一法适用于生牛乳和巴氏杀菌牛乳中αＧ乳白蛋白和βＧ乳球蛋白的测定;第二法适用于高温 杀菌牛乳、灭菌牛乳、牛乳粉和牛乳基婴幼儿配方乳粉中αＧ乳白蛋白和βＧ乳球蛋白的测定. 本文件生牛乳和巴氏杀菌牛乳中αＧ乳白蛋白定量限为２５mg/kg,βＧ乳球蛋白定量限为１００mg/kg; 高温杀菌牛乳和灭菌牛乳中αＧ乳白蛋白定量限为５０mg/kg,βＧ乳球蛋白定量限为１００mg/kg;牛乳粉和 牛乳基婴幼儿配方乳粉中αＧ乳白蛋白定量限为２５０mg/kg,βＧ乳球蛋白定量限为５００mg/kg. 注:本文件仅适用于未变性的αＧ乳白蛋白和βＧ乳球蛋白的测定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文 件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. 第一法　反相液相色谱法 ４　原理 试样用水溶解,调节pH至４􀆰６０,使酪蛋白和变性的乳清蛋白沉淀,未变性的αＧ乳白蛋白和βＧ乳球蛋 白仍保留在溶液中,离心后用高效液相色谱仪测定,外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:应符合GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰２　三氟乙酸:色谱级. ５􀆰３　乙酸:优级纯. ５􀆰４　乙腈:色谱级. ５􀆰５　三氟乙酸溶液(０􀆰１％):准确移取１mL三氟乙酸(５􀆰２),用水定容至１L,混匀,临用现配. ５􀆰６　三氟乙酸乙腈溶液(０􀆰１％):准确移取１mL三氟乙酸(５􀆰２),用乙腈(５􀆰４)定容至１L,混匀,临用现 配. ５􀆰７　混合标准储备溶液(１０mg/mL):准确称取适量αＧ乳白蛋白标准品(CAS号:９０５１Ｇ２９Ｇ０,纯度≥ ９５％)和βＧ乳球蛋白标准品(CAS号:９０４５Ｇ２３Ｇ２,纯度≥９５％)于１０mL容量瓶中,用水稀释并定容,混匀. －２０℃以下保存,有效期３个月. ５􀆰８　混合标准中间溶液(２００mg/L):准确移取２００μL混合标准储备溶液(５􀆰７),用水稀释并定容至１０ mL,混匀.临用现配. ５􀆰９　混合标准系列溶液:准确移取一定量的混合标准中间溶液(５􀆰８),用水稀释并定容,配制成浓度分别 １NY/T４６３０—２０２５ 为１mg/L、５mg/L、１０mg/L、２０mg/L、５０mg/L、１００mg/L和２００mg/L混合标准系列溶液.临用现 配. ５􀆰１０　微孔滤膜:水系,０􀆰２２μm. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱仪:配紫外检测器或二极管阵列检测器. ６􀆰２　天平:精度为０􀆰１mg和０􀆰０１mg. ６􀆰３　旋涡混合器. ６􀆰４　离心机:转速不低于１２０００r/min. ６􀆰５　pH计:精度为±０􀆰０１. ７　样品 取生牛乳或巴氏杀菌牛乳约２００g,混匀,装入洁净容器中.立即测定. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 平行做２份试验.称取试样５g(精确至０􀆰１mg)于５０mL离心管中,加１５mL水混匀,用乙酸(５􀆰３) 调节pH为４􀆰６０±０􀆰０５后,转移至２５mL容量瓶中,用水定容,混匀.转移至离心管中,静置１０min以 上,１２０００r/min离心１０min.准确移取上清液１mL于５mL容量瓶中,用水定容,混匀.过膜(５􀆰１０)为 试样溶液,待测. ８􀆰２　反相液相色谱参考条件 反相液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:C４色谱柱(３００̊A),柱长２５０mm,内径４􀆰６mm,粒径３􀆰５μm,或性能相当者. b)　检测波长:２１０nm. c)　流速:１􀆰５mL/min. d)　柱温:６０℃. e)　进样量:３０μL. f)　流动相:A为三氟乙酸溶液(５􀆰５),B为三氟乙酸乙腈溶液(５􀆰６);梯度洗脱条件见表１. 表１　梯度洗脱条件 时间 minA ％B ％ ０ ９５ ５ ６􀆰５ ６２ ３８ １０ ６２ ３８ ２２ ５９ ４１ ２２􀆰５ ４０ ６０ ２７􀆰５ ４０ ６０ ２８ ９５ ５ ３５ ９５ ５ ８􀆰３　测定 ８􀆰３􀆰１　标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取混合标准系列溶液(５􀆰９)和试样溶液(８􀆰１)上机测定.αＧ乳白蛋白和βＧ ２NY/T４６３０—２０２５ 乳球蛋白标准溶液的液相色谱图见附录A,βＧ乳球蛋白有βＧ乳球蛋白A和βＧ乳球蛋白B两个峰. ８􀆰３􀆰２　定性 以保留时间定性,试样溶液中αＧ乳白蛋白和βＧ乳球蛋白保留时间应分别与混合标准系列溶液(浓度相 当)中αＧ乳白蛋白和βＧ乳球蛋白的保留时间一致,其相对偏差为±２􀆰５％. ８􀆰３􀆰３　定量 分别以αＧ乳白蛋白和βＧ乳球蛋白的浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标(其中βＧ乳球蛋白以βＧ乳球蛋 白A和βＧ乳球蛋白B峰面积之和计),绘制标准曲线,其相关系数应不低于０􀆰９９.试样溶液中待测物的浓 度应在标准曲线的线性范围内.如超出范围,应将试样溶液用水稀释后,重新测定. ９　试验数据处理 试样中αＧ乳白蛋白或βＧ乳球蛋白的含量以质量分数ω１i计,单位为毫克每千克(mg/kg),按式(１)计 算: ω１i＝ρ１i×V３×V１×１０００ m１×V２×１０００×f１ (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: ρ１i———从标准曲线查得的试样溶液中αＧ乳白蛋白或βＧ乳球蛋白质量浓度的数值,单位为毫克每升 (mg/L); V３———上机液定容体积的数值,单位为毫升(mL); V１———试样处理液体积的数值,单位为毫升(mL); m１———试样质量的数值,单位为克(g); V２———吸取上清液体积的数值,单位为毫升(mL); １０００———换算系数; f１———超出曲线范围后的稀释倍数. 测定结果以平行测定的算术平均值表示,计算结果保留３位有效数字. １０　精密度 在重复性条件下,２次独立测试结果的绝对差值不大于该算术平均值的１０％. 第二法　凝胶渗透色谱法 １１　原理 试样用水溶解,调节pH至４􀆰６０,使酪蛋白和变性的乳清蛋白沉淀,以盐酸胍为变性剂,βＧ巯基乙醇为 还原剂,使未变性的αＧ乳白蛋白和βＧ乳球蛋白的硫－硫(S－S)化学键断开,形成αＧ乳白蛋白和βＧ乳球蛋 白的单体结构.经凝胶色谱柱分离,高效液相色谱仪测定,外标法定量. １２　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. １２􀆰１　水:应符合GB/T６６８２规定的一级水. １２􀆰２　βＧ巯基乙醇. １２􀆰３　盐酸溶液:取４５０mL的浓盐酸(含量３６􀆰０％~３８􀆰０％),用水稀释定容至５００mL,混匀. １２􀆰４　氢氧化钠溶液(５００g/L):称取２５０g氢氧化钠,加入适量水溶解,冷却至室温,定容至５００mL,混 匀. １２􀆰５　磷酸盐缓冲溶液:称取５６􀆰６g磷酸氢二钠、３􀆰５g磷酸二氢钠和２􀆰９g乙二胺四乙酸,加入８００mL 水溶解,混匀.用氢氧化钠溶液(１２􀆰４)或盐酸溶液(１２􀆰３)调节pH至７􀆰５±０􀆰１.将溶液转移至１L容量 瓶,用水定容,混匀.临用现配. ３NY/T４６３０—２０２５ １２􀆰６　盐酸胍缓冲溶液:称取５７３g盐酸胍,置于１０００mL烧杯中,添加１００mL磷酸盐缓冲溶液(１２􀆰５), 加水将该溶液稀释至约９００mL,同时不停搅拌,用氢氧化钠溶液(１２􀆰４)调节pH至７􀆰５±０􀆰１.将溶液 转移至１L容量瓶,用水定容,混匀.过滤膜(１２􀆰１０).临用现配. １２􀆰７　混合标准储备溶液(１０mg/