2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 微 生 物 肥 料 酶 活 效 应 测 定 方 法 1 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 8 0 C C S B 4 5 4 9 — 2 0 2 5 D e t e c t i o n m e t h o d s f o r t h e e n z y m e a c t i v i t y e f f e c t o f m i c r o b i a l f e r t i l i z e r Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４５４９—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 本文件由农业农村部种植业管理司提出. 本文件由农业农村部肥料标准化技术委员会归口. 本文件起草单位:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、农业农村部微生物肥料和食用菌菌种 质量检验测试中心、农业农村部微生物产品质量安全风险评估实验室(北京). 本文件主要起草人:马鸣超、姜昕、李俊、曹凤明、关大伟、李力、毛聪琳、贾聪、杨小红、陈慧君、朱玲玲、 刘孝颖. ⅠNY/T４５４９—２０２５ 　 　 　微生物肥料酶活效应测定方法 １　范围 本文件规定了微生物肥料酶活效应测定的原理、试剂和溶液、仪器设备、样品采集与试样制备、测试方 法、结果计算及精密度要求. 本文件适用于施用微生物肥料的土壤常见酶活力测定,施用其他肥料的土壤可参照执行. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６０１　化学试剂　标准滴定溶液的制备 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T３５５３８—２０１７　工业用酶制剂测定技术导则 NY/T１１１３—２００６　微生物肥料术语 NY/T１１２１􀆰１　土壤检测　第１部分:土壤样品的采集、处理和贮存 ３　术语和定义 NY/T１１１３—２００６界定的以及下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 微生物肥料　microbialfertilizer 含有特定微生物活体应用于农业生产的制品,通过其中所含微生物的生命活动,增加植物养分的供应 量或促进植物生长,增强抗逆性,提高产量,改善农产品品质及农业生态环境. [来源:NY/T１１１３—２００６,２􀆰１,有修改] 注:包含农用微生物菌剂、复合微生物肥料和生物有机肥三大类产品. ３􀆰２ 微生物肥料酶活效应　enzymeactivityeffectofmicrobialfertilizer 施用微生物肥料引起土壤酶活力变化的效果. ３􀆰３ 酶活力　enzymeactivity 酶在一定条件下催化某一特定反应的能力. [来源:GB/T３５５３８—２０１７,３􀆰２] ３􀆰４ 脲酶　urease 将尿素(脲)分解为氨和二氧化碳或碳酸铵的酶. ３􀆰５ 过氧化氢酶　catalase 将过氧化氢催化分解成氧和水的酶. ３􀆰６ 蔗糖酶　sucrase １NY/T４５４９—２０２５ 将蔗糖水解成为果糖和葡萄糖的酶. ３􀆰７ 纤维素酶　cellulase 将纤维素分解成寡糖或单糖的酶. ３􀆰８ 硝酸盐还原酶　nitratereductase 将硝酸盐还原成亚硝酸盐的一种含钼的酶. ３􀆰９ 蛋白酶　protease 催化蛋白质水解成肽并进一步水解成氨基酸的酶. ３􀆰１０ 磷酸酶　phosphatase 水解底物实现去磷酸化的酶. ３􀆰１１ 几丁质酶　chitinase 催化几丁质水解生成NＧ乙酰葡萄糖胺反应的酶. ４　试验方法 警示———整个分析操作过程应在指定区域内进行,避免阳光直射,具备相对独立的操作台和废弃物存 放装置.在整个实验过程中,操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施. ４􀆰１　土壤脲酶活力的测定(苯酚钠次氯酸钠比色法) ４􀆰１􀆰１　原理 本方法以尿素为底物,根据酶促产物氨与苯酚次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚,通过比色测定,表征脲 酶活力.在３７℃、pH６􀆰７条件下,２４h水解尿素产生１mgNH３ＧN的酶量为一个酶活力单位,单位以U 表示. ４􀆰１􀆰２　试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂,实验用水应符合GB/T６６８２中三级水的规定. ４􀆰１􀆰２􀆰１　甲苯(C７H８). ４􀆰１􀆰２􀆰２　尿素溶液(１０％):称取１０􀆰０g尿素(CH４N２O),用水溶解并定容至１００mL. ４􀆰１􀆰２􀆰３　柠檬酸盐缓冲液(pH＝６􀆰７):称取１８４􀆰０g柠檬酸(C６H８O７)和１４７􀆰５g氢氧化钾(KOH)分别 溶于水中,然后将两溶液混合,用１０％氢氧化钠溶液将pH调至６􀆰７,用水稀释并定容至１０００mL. ４􀆰１􀆰２􀆰４　苯酚钠溶液(１􀆰３５mol/L):称取６２􀆰５g苯酚(C６H５OH)溶于少量无水乙醇中,加入２􀆰０mL甲 醇和１８􀆰５mL丙酮,用乙醇定容至１００mL,此为A液,冰箱冷藏保存;称取２７􀆰０g氢氧化钠(NaOH),用 水溶解并定容至１００mL,此为B液,冰箱冷藏保存;使用时,将A液、B液各取２０􀆰０mL混合,用水定容至 １００mL. ４􀆰１􀆰２􀆰５　次氯酸钠溶液(有效氯０􀆰９％):量取有效氯浓度１０％次氯酸钠(NaClO)溶液９mL,用水定容至 １００mL. ４􀆰１􀆰２􀆰６　氮标准溶液(１００μg/mL):称取０􀆰４７１７g经干燥保存的硫酸铵[(NH４)２SO４],用水溶解并定 容至１０００mL. ４􀆰１􀆰２􀆰７　氮标准工作溶液(１０μg/mL):吸取１０􀆰０mL氮标准溶液(４􀆰１􀆰２􀆰６)定容至１００mL. ４􀆰１􀆰３　仪器设备 ４􀆰１􀆰３􀆰１　电子天平:感量０􀆰０００１g和感量０􀆰１g. ４􀆰１􀆰３􀆰２　试验筛:孔径１mm. ２NY/T４５４９—２０２５ ４􀆰１􀆰３􀆰３　酸度计:精确至０􀆰０１. ４􀆰１􀆰３􀆰４　紫外可见分光光度计. ４􀆰１􀆰３􀆰５　恒温培养箱:(３７±１)℃. ４􀆰１􀆰４　样品采集与试样制备 施用微生物肥料,按照NY/T１１２１􀆰１的规定采集土壤样品、制备试样,风干样品应通过１mm孔径试 验筛. ４􀆰１􀆰５　试验步骤 ４􀆰１􀆰５􀆰１　标准曲线绘制 分别取０mL、２􀆰０mL、４􀆰０mL、６􀆰０mL、８􀆰０mL、１０􀆰０mL氮标准工作溶液(４􀆰１􀆰２􀆰７),移至５０mL 容量瓶中,然后加水至２０mL,再加入４􀆰０mL苯酚钠溶液(４􀆰１􀆰２􀆰４)和３mL次氯酸钠溶液(４􀆰１􀆰２􀆰５),边 加入边摇匀,显色２０min,用水定容至５０mL,配成浓度为０μg/mL、０􀆰４μg/mL、０􀆰８μg/mL、１􀆰２μg/mL、 １􀆰６μg/mL、２􀆰０μg/mL的氮系列标准溶液.１h内,以０μg/mL氮标准溶液为空白调零,于５７８nm波 长处测定氮系列标准溶液吸光度.然后以吸光度为横坐标、氮系列标准溶液浓度为纵坐标,绘制标准 曲线. ４􀆰１􀆰５􀆰２　样品测定 称取风干土壤试样５g(精确至０􀆰００１g),置于５０mL具塞锥形瓶中,并加入１􀆰０mL甲苯(４􀆰１􀆰２􀆰１), 振荡均匀,静置１５min后,加入１０􀆰０mL尿素溶液(４􀆰１􀆰２􀆰２)和２０􀆰０mL柠檬酸盐缓冲液(４􀆰１􀆰２􀆰３),摇 匀后置入３７℃恒温培养箱内反应２４h.反应结束后用定性滤纸过滤,取１􀆰０mL滤液加入５０mL容量瓶 中,再加４􀆰０mL苯酚钠溶液(４􀆰１􀆰２􀆰４)和３mL次氯酸钠溶液(４􀆰１􀆰２􀆰５),边加入边摇匀.显色２０min, 用水定容至５０mL.１h内,以０μg/mL氮标准溶液为空白调零,于５７８nm波长处测定其吸光度.如果 样品吸光度超过标准曲线的最大值,则应该增加分取倍数或减少土壤试样称样量,重新测定. ４􀆰１􀆰５􀆰３　无尿素空白试验 每个样品应做无尿素空白试验,即不加尿素溶液,以等体积的水代替,其他操作同４􀆰１􀆰５􀆰２. ４􀆰１􀆰５􀆰４　无土空白试验 每次测定应做无土空白试验,不加土壤试样,其他操作同４􀆰１􀆰５􀆰２. ４􀆰１􀆰６　结果计算 土壤脲酶活力按公式(１)计算. X＝(c１－c２－c３)×V×D×２４ m×t×１０００(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: X　———土壤脲酶活力的数值,单位为酶活力单位每克(U/g); c１———样品吸光度由标准曲线求得NH３ＧN浓度的数值,单位为微克每毫升(μg/mL); c２———无尿素空白吸光度由标准曲线求得NH３ＧN浓度的数值,单位为微克每毫升(μg/mL); c３———无土空白吸光度由标准曲线求得NH３ＧN浓度的数值,单位为微克每毫升(μg/mL); V———显色后定容体积的数值,单位为毫升(mL); D———分取倍数,恒温培养反应液体积/吸取滤液体积; ２４———时间换算系数; m———土壤试样质量的数值,单位为克(g); t　———反应时间的数值,单位为小时(h); １０００———质量换算系数. 测定结果用２次平行测定的算术平均值表示,所得结果应保留２位小数. ４􀆰１􀆰７　精密度 在同一实验室,由同一操作者使用相同设备,按相同的测试方法,并在短时间内对同一被测对象相互 独立进行测试获得的２次独立测试结果的绝对差值不大于这２个测定值的算术平均值的２０％,以大于这 ３NY/T４５４９—２０２５ ２个测定值的算术平均值的２