2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 微 生 物 肥 料 功 能 菌 株 筛 选 与 鉴 评 通 则 1 0 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 8 0 C C S B 4 5 4 3 — 2 0 2 5 G e n e r a l p r i n c i p l e s f o r s c r e e n i n g a n d e v a l u a t i o n o f f u n c t i o n a l s t r a i n s o f m i c r o b i a l f e r t i l i z e r Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４５４３—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件由农业农村部种植业管理司提出. 本文件由农业农村部肥料标准化技术委员会归口. 本文件起草单位:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、农业农村部微生物肥料和食用菌菌种 质量监督检验测试中心、农业农村部微生物产品质量安全风险评估实验室(北京). 本文件主要起草人:杨小红、李俊、姜昕、马鸣超、曹凤明、关大伟、李力、陈慧君、冯瑞华、葛一凡、朱玲 玲、贾聪、季洪伟、毛聪琳、刘孝颖. ⅠNY/T４５４３—２０２５ 微生物肥料功能菌株筛选与鉴评通则 １　范围 本文件规定了微生物肥料功能菌株筛选与鉴评的一般要求、技术流程和实施要求. 本文件适用于微生物肥料功能菌株的筛选、鉴定和评价. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅 该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB/T４１７２７　农用微生物菌剂功能评价技术规程 GB/T４１７２８　微生物肥料质量安全评价通用准则 NY/T１１１３　微生物肥料术语 NY/T１５３６　微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南 NY/T１７３５　根瘤菌生产菌株质量评价技术规范 NY/T１７３６　微生物肥料菌种鉴定技术规范 NY/T１８４７　微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 微生物肥料　microbialfertilizer 含有特定微生物活体应用于农业生产的制品,通过其中所含微生物的生命活动,增加植物养分的供应 量或促进植物生长,增强抗逆性,提高产量,改善农产品品质及农业生态环境. [来源:NY/T１１１３—２００６,２􀆰１,有修改] ３􀆰２　 微生物肥料效应　microbialfertilizereffect 微生物肥料对植物产量和抗逆能力、农产品品质、土壤质量改善的效果. [来源:NY/T１１１３—２００６,７􀆰１６,有修改] ３􀆰３　 功能菌株　functionalstrain 具有养分活化、植物促生、植物抗逆、有机物料促腐、土壤改良与修复等效应的微生物. ３􀆰４　 筛选　screening 从微生物的群体中,采取相关的技术,选择出目标菌株的过程. [来源:NY/T１１１３—２００６,３􀆰７,有修改] ３􀆰５ 富集　enrichment 利用不同微生物间的生长代谢及环境耐受差异,通过设置特定条件,促进微生物群体中目标微生物大 量生长,实现其数量优势的培养过程. ３􀆰６ 驯化　domestication １NY/T４５４３—２０２５ 在微生物培养过程中,通过渐进式加入靶向物质或进入靶向环境等措施,使微生物逐步适应某特定营 养或环境的过程. ３􀆰７ 分离　isolation 从含有目标微生物的样品中,将目标微生物培养出来的过程. [来源:NY/T１１１３—２００６,３􀆰５,有修改] ３􀆰８ 纯化　purification 从微生物群体中,去除杂菌,获得同一种目标微生物个体的过程. [来源:NY/T１１１３—２００６,３􀆰６,有修改] ３􀆰９ 鉴评　identificationandevaluation 对目标微生物进行分类鉴定及菌株功能性、安全性评价的过程. ４　一般要求 ４􀆰１　筛选 ４􀆰１􀆰１　依据设定的功能目标,确定菌株的筛选方案、程序及技术方法. ４􀆰１􀆰２　根据目标菌最可能存在的环境位置,确定适宜的采样地点与取样方案,采集目标菌筛选的环境 样品. ４􀆰１􀆰３　依据目标菌类别及其应用环境条件,确定适宜的培养基、培养条件、筛选方法等技术方案. ４􀆰１􀆰４　菌株的初筛以菌种数量为主,采用快速、有效及易识别的方法进行. ４􀆰１􀆰５　菌株的复筛以菌种功能为主,筛选条件应接近生产应用实际,可同时选用２种及２种以上的方法 进行,以增加功能菌株的筛选效率. ４􀆰１􀆰６　宜从土壤、动植物体、特定水体等环境中筛选功能菌株.菌种来源也可以是菌种保藏机构、科研机 构等保存的资源. ４􀆰２　鉴评 筛选出的待测菌株先进行菌种鉴定和安全性评价,待其安全性符合要求后再进行功能性评价. ５　技术流程 微生物肥料功能菌株筛选与鉴评程序主要包括功能菌株的筛选(６􀆰１)和功能菌株的鉴评(６􀆰２)两部 分.其中,功能菌株的筛选(６􀆰１)包括６个阶段:样品采集(６􀆰１􀆰１)、富集(６􀆰１􀆰２)、驯化(６􀆰１􀆰３)、初筛 (６􀆰１􀆰４)、分离、纯化(６􀆰１􀆰５)和复筛(６􀆰１􀆰６).功能菌株的鉴评(６􀆰２)包括菌株的分类鉴定(６􀆰２􀆰１)、安全性 评价(６􀆰２􀆰２)和功能性评价(６􀆰２􀆰３).功能菌株筛选与鉴评技术流程如图１所示. ６　实施 ６􀆰１　筛选实施 ６􀆰１􀆰１　样品采集操作如下: a)　依据样品类型和目标菌株特性,确定采样的地理位置、气候特征、土壤及植被类型、深度、时间等; b)　用无菌器具(铁锹、小铲或其他器具),采用对角线法或随机法５点采样,每点取样５００g(mL)左 右,充分混匀,而后采用四分法取大约５００g(mL),固体样品过筛处理,放入无菌采样袋或瓶中; c)　封口并做好标记,低温储运至实验室,４℃保存; d)　取部分样品,进行理化和生物指标的分析; e)　剩余样品可进入富集、驯化、初筛或分离、纯化. 注１:根瘤菌样品的采集按照附录A中A􀆰１的规定执行. ２NY/T４５４３—２０２５ 图１　功能菌株筛选与鉴评技术流程 ６􀆰１􀆰２　富集操作如下: a)　配制适宜的富集培养基. b)　制备样品悬液:称取１０􀆰０g(mL)样品于装有９０mL无菌水(或磷酸缓冲液pH７􀆰０或生理盐水) 和少量玻璃珠的２５０mL三角瓶中.适宜温度下,２００r/min振荡３０min,静置,上清液即为样品 悬液. c)　取适量样品悬液或采集的液体样品(可根据需要进行适当稀释)加入富集培养基,通过控制培养 条件(营养、酸碱度、盐度、温度、加入抗生素等)实现富集. d)　按一定接种量转接至培养基中,依富集程度确定转接次数.如果目标菌数量太少,可将培养液离 心浓缩,而后再进入分离、纯化、驯化或初筛. ６􀆰１􀆰３　驯化操作如下: a)　配制适宜的驯化培养基; b)　制备样品悬液,操作方法同６􀆰１􀆰２b); c)　将样品悬液或采集的液体样品或富集培养物按一定量接种到驯化培养基,在特定驯化条件下进 行逐级驯化培养; d)　驯化好的培养物进入分离、纯化或初筛. ６􀆰１􀆰４　初筛操作如下: a)　根据不同目标菌的功能,选择适宜的方法进行初筛. １)　拮抗菌平板快速检测法按照附录B中B􀆰１的规定执行; ２)　非拮抗菌平板快速检测法按照附录B中B􀆰２的规定执行, ３)　非拮抗菌高通量筛选法按照附录B中B􀆰３的规定执行; ４)　分子筛选法按照附录B中B􀆰４的规定执行; ５)　复合系筛选法按照附录B中B􀆰５的规定执行; ６)　共生匹配能力筛选法按照NY/T１７３５的规定执行. ３NY/T４５４３—２０２５ b)　初筛结束,符合要求的菌株进入分离、纯化或复筛. ６􀆰１􀆰５　分离、纯化操作如下: a)　根据需要制备样品悬液,方法同６􀆰１􀆰２b); b)　用无菌水对样品悬液进行１０倍系列稀释; c)　取０􀆰１mL适宜梯度稀释液加入适宜的培养基,表面涂布均匀,每稀释度至少３次重复; d)　置适宜条件进行培养; e)　选取典型菌落继续划线分离、纯化直至获得纯培养物; f)　获得的纯培养物进入初筛或复筛. 注２:根瘤菌的分离、纯化分别按照附录A中A􀆰２和A􀆰３的规定执行. ６􀆰１􀆰６　复筛操作如下: a)　根据不同目标菌的功能,选择适宜的方法进行复筛. １)　摇瓶法按照附录C中C􀆰１的规定执行; ２)　盆栽法按照附录C中C􀆰２的规定执行; ３)　失重法按照附录C中C􀆰３的规定执行; ４)　抑菌圈法(打孔法)按照附录C中C􀆰４的规定执行; ５)　离体叶片法按照附录C中C􀆰５的规定执行. b)　复筛结束,符合要求的菌株进入分类鉴定和安全性评价. ６􀆰２　鉴评实施 ６􀆰２􀆰１　分类鉴定 菌株的分类鉴定应按照NY/T１７３６的规定执行. ６􀆰２􀆰２　安全性评价 菌株的安全性评价应按照GB/T４１７２８的规定执行.不符合安全性要求的菌株,灭活后弃用;符合安 全性要求的菌株,进入功能性评价. ６􀆰２􀆰３　功能性评价 菌株的功能性评价应按照NY/T１８４７、NY/T１５３６或GB/T４１７２７的规定执行. ４NY/T４５４３—２０２５ 附　录　A (规范性) 根瘤菌的样品采集和分离、纯化 A􀆰１　根瘤菌的