2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 三 七 种 子 种 苗 腐 皮 镰 刀 菌 检 测 方 法 1 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 2 0 C C S B 4 5 2 4 — 2 0 2 5 D e t e c t i o n m e t h o d f o r F u s a r i u m s o l a n i i n P a n a x n o t o g i n s e n g s e e d s a n d s e e d l i n g s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４５２４—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:中国农业科学院植物保护研究所、文山七麟三七科技有限公司. 本文件主要起草人:李园、曹坳程、王秋霞、颜冬冬、方文生、刘晓漫、张敏、吴佳佳、朱佳红、王麟猛. ⅠNY/T４５２４—２０２５ 三七种子种苗腐皮镰刀菌检测方法 １　范围 本文件规定了三七(Panaxnotoginseng)种子和种苗中腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)的检测方法,包 括形态学检测方法(第一章)、PCR检测方法(第二章)和实时荧光定量PCR检测方法(第三章). 本文件适用于三七种子和种苗中腐皮镰刀菌的检测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(BasePair) dNTP:脱氧核苷三磷酸(DeoxyribonucleosideTriphosphates) PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(CetyltrimethylAmmoniumBromide) Taq酶:DNA聚合酶(TaqDNAPolymerase) qPCR:实时荧光定量PCR(QuantitativeRealTimePCR) Ct:循环阈值(CycleThreshold) ５　腐皮镰刀菌基本信息 腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)属于瘤座孢科Tuberculariaceae镰刀菌属Fusarium成员,菌落呈白色、细 密绒毛状,菌丝有隔,分枝.分生孢子梗分枝或不分枝.分生孢子有２种形态,小型分生孢子卵圆形至柱形, 有１个~２个隔膜;大型分生孢子镰刀形或长柱形,有较多的横隔.腐皮镰刀菌其他信息见附录A. ６　样品 ６􀆰１　种子 种子外部检测,需随机选取１００粒待检种子,放入灭菌的２５０mL三角瓶中,加入５０mL无菌水后置 于１２０r/min的摇床上,室温下充分振荡３０min.吸取１０mL悬浮液,于２０００r/min的离心机中离心 １０min,弃去上清液.加入５mL无菌水,充分振荡后吸取１mL悬浮液,用无菌水进行１０倍系列梯度稀 释至１０００倍.种子内部检测,需随机选取１００粒待检种子,在１％次氯酸钠溶液中浸泡１０min,取出种 子,用无菌水冲洗３次,在培养皿底部铺上两层灭菌滤纸,将种子倒入其中,用滤纸吸干种子表面的水分. 如果进行PCR及qPCR检测,则将表面消毒后的上述种子置于灭菌后的研钵中,加入等质量无菌水,充分 研磨制成组织研磨液.如果种子样品不能及时检测,保存温度应为１５℃~１８℃. ６􀆰２　种苗 送检三七种苗样品应为新鲜采集.称取根茎组织２g~３g,用７５％乙醇浸泡３０s,或者用１％次氯酸 １NY/T４５２４—２０２５ 钠溶液浸泡５min,进行表面消毒,取出后在无菌水中清洗干净,晾干,置于灭菌后的研钵中,加入等质量 无菌水,充分研磨制成组织研磨液.如果种苗样品不能及时检测,应放置于４℃保存. 第一章　形态学检测方法 ７　仪器与设备 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他主要仪器与设备如下: a)　超净工作台:高效滤膜可除去９９􀆰９９％以上的０􀆰３μm粒子. b)　恒温培养箱. c)　全温摇瓶柜:４０r/min~２８０r/min,５℃~６０℃; d)　高速台式离心机:最大转速≥１００００r/min; e)　显微镜:２０×~１００×; f)　微量移液器:１００μL、１mL、５mL、１０mL,并配备与移液器匹配的枪头. ８　培养基 ８􀆰１　马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 称取马铃薯２００g,去皮切成小块,加入１０００mL去离子水中煮沸５min~１０min,用纱布将马铃薯残 渣滤去,往滤液中加入葡萄糖２０g、琼脂粉１５g,再添加蒸馏水定容至１０００mL,灭菌倒平板备用. ８􀆰２　Komada培养基 A组分的配制:氯化钾KCl１g、硫酸镁MgSO４１g、磷酸氢二钾K２HPO４２g、LＧ天冬碱LＧAsparagine ４g、DＧ半乳糖DＧGalactose４０g、琼脂Agar３０g,加入１９００mL蒸馏水,煮沸,分装于１００mL三角瓶, 灭菌. B组分的配制:乙二胺四乙酸铁钠FeＧNaEDTA０􀆰０２g、十水合四硼酸钠Na２B４O７􀅰１０H２O２g、牛 胆汁粉Oxgall１g、五氯硝基苯Pentachloronitrobenzene１􀆰５g、硫酸链霉素Steptomycinsulfate１g,加入 １００mL灭菌水,摇匀. 在无菌操作台中,向４７􀆰５mLA组分内加入２􀆰５mLB组分,摇匀后均分倒入３个培养皿内. ９　检测 ９􀆰１　种子 ９􀆰１􀆰１　种子外部 吸取１００μL６􀆰１制得的悬浮液,均匀涂布于直径为９cm的PDA平板上,每个浓度梯度３次重复,相 同条件下设无菌水空白对照.将涂布好的平板置于２５℃恒温箱,黑暗条件下培养,３d~５d后观察. ９􀆰１􀆰２　种子内部 将按６􀆰１处理后的种子均匀摆放在直径为９cm的PDA平板上,每皿１０粒,共１０皿,置于２５℃恒温 箱,黑暗条件下培养,５d~７d后观察. ９􀆰２　种苗 在无菌条件下,用灭菌接种环蘸取６􀆰２方法制备的组织研磨液涂布在Komada培养基上,每个样品３ 次重复.同时,涂板腐皮镰刀菌标准菌株菌悬液作为阳性对照.将涂布好的平板置于２８℃恒温箱,黑暗 条件下培养,３d~５d后观察有无菌落形成及菌落特征. １０　结果与判定 将分离到的真菌转移到PDA培养基进行纯化、镜检、转管保存.根据真菌培养性状和形态特征,参 照«真菌鉴定手册»«真菌学»«植病研究方法»等工具书,通过观察菌株的菌落形态、菌丝和孢子形态特征进 行菌株鉴定,真菌形态特征与５相符,可判定样品中存在腐皮镰刀菌. ２NY/T４５２４—２０２５ 第二章　PCR检测方法 １１　原理 基于腐皮镰刀菌中TEFＧ１α基因的核苷酸序列,设计特异性PCR检测引物,对样品进行PCR扩增, 根据PCR电泳结果,确定样品中是否含有腐皮镰刀菌. １２　仪器与设备 除采用第一章中７所用的仪器与设备外,其他主要仪器与设备如下: １２􀆰１　电子天平:感量０􀆰０１g. １２􀆰２　高通量组织研磨仪. １２􀆰３　冰箱:－８０℃、－２０℃、２℃~４℃. １２􀆰４　PCR扩增仪:温度范围４℃~９９℃,控温精度±０􀆰２５℃. １２􀆰５　电泳仪:输出电压５V~６００V,输出电流２mA~２００mA. １２􀆰６　凝胶成像系统:包括３０２nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV干涉滤光片、机载头像捕 捉软件、图像分析软件. １３　试剂与耗材 除非另有规定外,在分析中仅使用分析纯试剂,实验用水符合GB/T６６８２的二级水指标,其中涉及 PCR的用水要求达到一级水指标. １３􀆰１　CTAB裂解液:取２gCTAB、８􀆰１８gNaCl、０􀆰７４g乙二胺四乙酸二钠二水合物EDTA􀅰Na２􀅰 ２H２O,加入１０mL１mol/L的TrisＧHCl(pH＝８􀆰０)、０􀆰２mL巯基乙醇,加水定容到１００mL.高温高压 灭菌后,室温保存. １３􀆰２　石英砂. １３􀆰３　乙酸钠:３mol/L(pH＝５􀆰２).称量４０􀆰８g三水合乙酸钠CH３COONa􀅰３H２O置于１００mL~ ２００mL烧杯中加入约８０mL的去离子水搅拌溶解.加入冰醋酸调节pH至５􀆰２,加去离子水将溶液定容 至１００mL.高温高压灭菌后,室温保存. １３􀆰４　dNTPs:dATP、dTTP、dGTP、dCTP. １３􀆰５　１０×PCR缓冲液. １３􀆰６　Taq酶. １３􀆰７　琼脂糖. １３􀆰８　核酸染料(凝胶绿). １３􀆰９　DL２０００DNA分子量标准. １３􀆰１０　氯化镁:２５mmol/L. １３􀆰１１　酚Ｇ三氯甲烷Ｇ异戊醇混合液(２５∶２４∶１). １３􀆰１２　三氯甲烷Ｇ异戊醇混合液(２４∶１). １３􀆰１３　１０mg/mLRNA酶. １３􀆰１４　基因组DNA提取试剂盒. １３􀆰１５　检测引物: ８４１Ｇ２F:５′ＧGCTTCTCCCGAGTCCCAAAAＧ３′. ８４１Ｇ２R:５′ＧATTGTTGGACCGGTTAGCGTＧ３′. 扩增片段大小:１７５bp. １３􀆰１６　离心管:１