2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 烟 草 品 种 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 5 2 3 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f t o b a c c o v a r i e t i e s — S S R m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４５２３—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　主要仪器设备及试剂 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　溶液配制 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　引物信息及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　参照品种及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果统计与表述 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　主要仪器设备及试剂 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(规范性)　溶液配制 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(规范性)　引物及序列 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　引物相关信息 １１ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(资料性)　参照品种相关信息 ２０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４５２３—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院烟草研究所、江苏中烟工业有限责任公司. 本文件主要起草人:任民、刘国祥、杨爱国、孙洋洋、田震、李媛、王珂清、程立锐、刘旦、佟英、陈帅、武 秀明. ⅡNY/T４５２３—２０２５ 烟草品种鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(SSR)进行烟草(NicotianatabacumL􀆰)品种鉴定的术语和定义、缩 略语、原理、主要仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息及使用、参照品种及使用、操作程序、结果判定与 表述. 本文件适用于烟草品种的DNA分子数据采集和品种鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　扦样 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T２５９４　植物品种鉴定　DNA分子标记法　总则 ３　术语和定义 NY/T２５９４界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. APS:过硫酸铵(ammoniumpersulphate). bp:碱基对(basepair). CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide). DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid). dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyＧribonucleosidetriphosphates). EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid). PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis). PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction). SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat). Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase). TBE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ硼酸盐Ｇ乙二胺四乙酸(TrisＧborateＧEDTA). TE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ乙二胺四乙酸(TrisＧEDTA). TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N′,N′Ｇtetramethylethylenediamine). Tris:三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM]. ５　原理 烟草品种基因组存在着大量能够稳定遗传的SSR标记,不同烟草品种在同一SSR的重复次数存在 差异,这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测,进而区分不同的品种. ６　主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂见附录A. １NY/T４５２３—２０２５ ７　溶液配制 溶液配制方法见附录B. ８　引物信息及使用 引物及序列见附录C,引物相关信息见附录D.利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测时选择普 通引物;利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物,荧光标记位于正向引物５′端.可利用附录C中 的引物序贯检测,当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品不同时,停止检测. ９　参照品种及使用 参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异,宜与送检样品同时检测,参照品种相关信息 见附录E. １０　操作程序 １０􀆰１　样品准备 送检样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官.种子样品需扦样时,应符合GB/T３５４３􀆰２的规定.每 份样品不少于３０个个体,等量混合分析,必要时进行个体检测. １０􀆰２　DNA提取 取混合样本约２００mg,置于２􀆰０mL圆底离心管,液氮冷冻后充分研磨;每管加入６００μL预热到 ６５℃的CTAB提取液,充分混合,６５℃水浴４５min~６０min,每隔１５min轻缓颠倒混匀,水浴后 １２０００r/min离心１０min.吸取上清液转移至新的离心管中,每管加入等体积的三氯甲烷和异戊醇混合 液,轻缓混匀后静置１０min,１２０００r/min离心１０min.吸取上清液转移至新的离心管中,加入等体积预 冷的异丙醇,轻轻颠倒混匀,－２０℃放置３０min,DNA沉淀后１２０００r/min离心１０min.弃上清液,用 体积分数为７０％的乙醇溶液洗涤２遍,弃乙醇,室温晾干,加入１００μL双蒸水或TE缓冲液充分溶解,检 测DNA浓度和纯度,－２０℃保存备用. 注１:以上为推荐的DNA提取方法,DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用于本标准.DNA 溶液的紫外吸光度OD２６０与OD２８０的比值宜介于１􀆰７~２􀆰０. 注２:三氯甲烷和异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为２４∶１. １０􀆰３　PCR扩增 １０􀆰３􀆰１　反应体系 PCR扩增反应体系的总体积和各组分的终浓度参照表１配制,可以依据试验条件调整. 表１　PCR扩增反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 推荐体积,μL １０×缓冲液(含MgCl２) １０× １× ２􀆰０ dNTPs ２􀆰５mmol/L ０􀆰２mmol/L １􀆰６ Taq酶 ５U/μL ０􀆰０５U/μL ０􀆰２ 正向引物 ５μmol/L ０􀆰２５(mol/L １􀆰０ 反向引物 ５μmol/L ０􀆰２５(mol/L １􀆰０ DNA ２５ng/μL ２􀆰５ng/μL ２􀆰０ 双蒸水 — — １２􀆰２ 总体积 ２０􀆰０ １０􀆰３􀆰２　反应程序 推荐反应程序:９４℃预变性５min;９４℃变性４５s,５４℃退火４５s,７２℃延伸６０s,共３５个循环; ７２℃延伸１０min,产物４℃保存. 反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而做适当的调整. ２NY/T４５２３—２０２５ １０􀆰４　PCR产物检测 １０􀆰４􀆰１　垂直板变性PAGE １０􀆰４􀆰１􀆰１　制胶 用洗涤剂将玻璃板清洗干净,再用双蒸水、无水乙醇分别擦洗２遍.玻璃板干燥后,将１􀆰０mL亲和 硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上,将１􀆰０mL剥离硅烷工作液均匀涂在带凹槽的短玻璃板上.操作过程 中防止两块玻璃板互相污染.玻璃板彻底干燥后,将０􀆰４mm厚的塑