2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 人 参 不 定 根 组 培 技 术 规 程 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 5 2 2 — 2 0 2 5 T e c h n i c a l c o d e o f p r a c t i c e f o r t i s s u e c u l t u r e d o n g i n s e n g a d v e n t i t i o u s r o o t Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４５２２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:中国标准化研究院、山东安然纳米实业发展有限公司、哈尔滨工业大学(威海)、深圳 市标准技术研究院、中国林科院林业所、天津大学. 本文件主要起草人:席兴军、张明臣、刘金坤、高秀君、杨志花、刘冰、宋颜香、裴东、高文远、闫培生. ⅠNY/T４５２２—２０２５ 　 　 　人参不定根组培技术规程 １　范围 本文件确立了人参(PanaxginsengC􀆰A􀆰Mey􀆰)不定根组培流程,描述了设备设施与仪器、试剂和材 料、培养基母液和培养基配制及保存、外植体前处理、组织培养、生产培养、清洗与干燥等阶段的操作指示 以及信息记录与档案等证实方法. 本文件适用于以鲜人参根为外植体,以生产高皂苷含量组织培养物为目的所开展的不定根组织培养. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 LY/T１８８２—２０１０　林木组织培养育苗技术规程 ３　术语和定义 LY/T１８８２—２０１０界定的以及下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 人参不定根　adventitiousrootofPanaxginseng 人参种源诱导出愈伤组织、分化培养形成不定根,通过筛选获得工作种源,再经三级培养、清洗、干燥 等步骤制得的产品. ３􀆰２ 分化培养　differentiationculture 再次培养过程中,愈伤组织经过分化形成了不定根的过程,也称为不定根诱导. ３􀆰３ 外植体　explant 用于植物组织培养的各种器官组织. [来源:LY/T１８８２—２０１０,３􀆰３] ３􀆰４ 培养基母液　mediumstocksolution 按试剂种类和性质分别配制的高于培养基配方浓度的溶液. [来源:LY/T１８８２—２０１０,３􀆰５] ３􀆰５ 诱导培养　inducingculture 在无菌条件下,将经体表面灭菌后的外植体植入培养基后,进行愈伤组织或不定根诱导的过程. ３􀆰６ 继代培养　subculture 外植体经过诱导培养后,再次及之后各次接种于新培养基继续培养的过程. [来源:LY/T１８８２—２０１０,３􀆰７,有修改] ３􀆰７ 扩大培养　extendedculture １NY/T４５２２—２０２５ 将继代培养之后的不定根,转入体积逐级增加的新液体培养基,实现大规模快速生产的过程. ４　人参不定根组培流程 人参不定根组培流程见图１. 图１　图１人参不定根组培技术流程 ５　设备设施与仪器 ５􀆰１　设施 组织培养区域的空气洁净度应达到１０万级以上;无菌操作间整体空气洁净度应达到万级以上;超净 工作台应达到百级以上. ５􀆰２　设备 ５􀆰２􀆰１　超净工作台:不高于ISO５级(１００级)、平均风速０􀆰３０m/s~０􀆰６０m/s,需带紫外灯,功率８W 以上. ５􀆰２􀆰２　高压蒸汽灭菌器(锅):最高使用压力０􀆰２５５MPa. ５􀆰２􀆰３　恒温恒湿培养箱或培养室:温度调节范围０℃~６０℃、相对湿度调节范围４０％~９０％. ５􀆰２􀆰４　恒温振荡培养箱:温度调节范围５℃~６０℃、振荡频率２０r/min~３００r/min. ５􀆰２􀆰５　烘箱:最高温度≥２５０℃. ５􀆰２􀆰６　冰箱:调节范围－２０℃~０℃. ５􀆰２􀆰７　电子天平:感量０􀆰０１g以下. ５􀆰２􀆰８　移液器(管):量程１􀆰００mL、量程５􀆰００mL. ５􀆰２􀆰９　pH计:０􀆰０１级pH计,最小显示值０􀆰０１. ５􀆰２􀆰１０　　纯净水机组或装置:电导率应小于５μS/cm(２５℃). ５􀆰２􀆰１１　生物反应器:具有剪切装置、具备可过滤０􀆰０１μm的空气过滤器、食品级不锈钢材料、通气量为 每升发酵液(培养基)每分钟通无菌空气０􀆰１L~０􀆰５L. ５􀆰２􀆰１２　无菌培养皿、手术刀、镊子、酒精灯等. ６　试剂和材料 ６􀆰１　蔗糖:食品级. ６􀆰２　植物凝胶:植物细胞培养级. ６􀆰３　B５培养基:植物细胞培养级. ６􀆰４　WPM培养基:植物细胞培养级. ６􀆰５　１/２MS培养基:生化级. ６􀆰６　６Ｇ苄氨基腺嘌呤:植物细胞培养级. ６􀆰７　萘乙酸:植物细胞培养级. ６􀆰８　赤霉素:分析纯. ６􀆰９　吲哚乙酸:植物细胞培养级. ２NY/T４５２２—２０２５ ６􀆰１０　吲哚丁酸:植物细胞培养级. ６􀆰１１　柠檬酸:植物细胞培养级. ６􀆰１２　抗坏血酸:植物细胞培养级. ６􀆰１３　纯净水:符合GB６６８２中三级水的要求. ６􀆰１４　无菌水:经灭菌处理的纯净水. ７　培养基母液和培养基配制及保存 ７􀆰１　培养基母液 ７􀆰１􀆰１　配制 ７􀆰１􀆰１􀆰１　配制用水为纯净水(６􀆰１３). ７􀆰１􀆰１􀆰２　母液配制方法见附录A. ７􀆰１􀆰２　保存 ７􀆰１􀆰２􀆰１　母液容器应贴有标签,标签中标注名称、配置倍数、配制日期、有效期和配制人. ７􀆰１􀆰２􀆰２　发现标签不明或母液中有沉淀或浑浊现象以及密封不严的应停止使用. ７􀆰１􀆰２􀆰３　母液保存条件和标签内容按附录A执行. ７􀆰２　培养基 ７􀆰２􀆰１　配制 ７􀆰２􀆰１􀆰１　诱导和继代培养基 分别称取蔗糖３０􀆰００g、植物凝胶３􀆰００g、B５培养基１􀆰５５g、WPM培养基１􀆰２１g,用移液器(管)移取 萘乙酸母液２０􀆰００mL、激动素母液６􀆰５０mL、赤霉素母液３􀆰００mL、柠檬酸母液６􀆰５０mL、抗坏血酸母液 ５􀆰００mL,用纯净水定容至１０００mL溶液,调节pH在５􀆰７０~５􀆰９０后进行分装备用. ７􀆰２􀆰１􀆰２　扩大培养基 分别称取蔗糖４０􀆰００g、B５培养基１􀆰２８g、１/２MS培养基０􀆰９１g、用移液器(管)移取吲哚丁酸母液 ２１􀆰００mL、萘乙酸母液１５􀆰００mL、赤霉素母液４􀆰００mL、吲哚乙酸母液３􀆰００mL、６Ｇ苄氨基腺嘌呤母液 ３􀆰００mL,用纯净水定容至１０００mL溶液,调节pH在５􀆰７０~５􀆰９０后进行分装备用. 注:按照量产规模等比例配制. ７􀆰２􀆰２　封口 将配制好的培养基及时盖好器皿口或采用封口膜封口.７􀆰２􀆰３　灭菌７􀆰２􀆰３􀆰１　培养基配制后应尽 快灭菌;１８℃~３０℃温度下应在８h内完成灭菌.７􀆰２􀆰３􀆰２　灭菌方法 不同成分的培养基的灭菌方法如下: a)　培养基成分中含有植物激素和维生素C等成分时采用过滤除菌等温和方式灭菌; b)除了植物激素和维生素C外的培养基成分采用高压蒸汽,灭菌条件为压力０􀆰１０５MPa,灭菌温度 和时间应符合表１的要求.灭菌完成后在超净工作台内将植物激素、维生素C按照配方用量加 入基础培养基. 表１　培养基灭菌条件 培养基容积,mL 灭菌时间,min 灭菌温度,℃ ５００~１０００ ２５ １２１(±１) ２０００００~１００００００ ３０ １２２􀆰５(±１) ７􀆰２􀆰４　保存 ７􀆰２􀆰４􀆰１　诱导培养基、继代培养基 在超净工作台将灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中,凝固后封口、编号,标示配制日期.在防尘、避 光、１８℃~３０℃的常温条件下存放,７d内使用,２℃~８℃低温下存放,１４d内使用. ３NY/T４５２２—２０２５ ７􀆰２􀆰４􀆰２　　扩大培养基 将灭菌后的培养基封口、编号,标示配制日期.在防尘、避光和１８℃~３０℃的常温条件下存放,７d 内使用,２℃~８℃低温下条件下存放,１４d内使用. ８　外植体前处理 ８􀆰１　外植体选择 应选择无腐烂、无病疤的鲜人参根作为外植体. ８􀆰２　外植体消毒 ８􀆰２􀆰１　一次消毒 将外植体清洗干净放入超净工作台内,用７５％的乙醇浸泡３０s~１２０s消毒后,用无菌纯净水冲洗外 植体２次~３次. ８􀆰２􀆰２　二次消毒 外植体可选择表２中任一种消毒剂进行浸泡消毒.消毒时间应符合表２的规定.消毒后用无菌水冲 洗外植体４次~６次. 表２　外植体消毒方法 消毒试剂 浓度,％ 消毒时间,min 次氯酸钠 １~２ ５~３０ 过氧化氢 １０~１２ ５~１５ 次氯酸钙 ９~１０ ５~３０ ９　组织培养 ９􀆰１　诱导培养 ９􀆰１􀆰１　在超净工作台内将已消毒外植体切成厚度０􀆰２mm~０􀆰５mm、长或宽５􀆰０mm~７􀆰０mm的不规 则薄片,接种到诱导培养基中. ９􀆰１􀆰２　接种量为１􀆰５g~６􀆰８g/L或１􀆰５g~６􀆰８g/１０００g. ９􀆰１􀆰３　在恒温恒湿箱或培养装置中按以下条件下进行培养: a)　温度为２２℃~２５℃; b)湿度为６０％~８０％; c)避光培养２８d~３５d.