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2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 - - 2 0 2 5 0 5 0 1 - - 实 施 莴 苣 品 种 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 : X X X X - X X X X I C S 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 4 9 4 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f l e t t u c e ( L a c t u c a s a t i v a L . ) v a r i e t i e s — S S R m a r k e r m e t h o d N Y / T 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T4494—2025 目  次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 1 范围 1 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 2 规范性引用文件 1 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 3 术语和定义 1 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 4 缩略语 1 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 5 原理 1 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 6 主要仪器设备及试剂 1 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 7 溶液配制 2 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 8 引物相关信息 2 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 9 参照品种 2 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 10 操作程序 2 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 11 结果统计 4 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 12 结果判定 4 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性) 主要仪器设备及试剂 5 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(规范性) 溶液配制 7 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(规范性) 引物名单及序列 9 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性) 引物相关信息 10 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(资料性) 参照品种相关信息 16 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T4494—2025 前  言 本文件按照GB/T1􀆰1—2020«标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起 草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC277)归口. 本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、华南农业大学、上海市农业科学院、北京市农林科学院. 本文件主要起草人:邓超、凌晨、徐振江、赵洪、李波、颜军、庞雪兵、王晨宇、马莹雪、张靖立、冯艳芳、唐 浩、陈红、张秀杰. ⅡNY/T4494—2025 莴苣品种鉴定 SSR分子标记法 1 范围 本文件规定了利用简单重复序列(SSR)标记进行莴苣(LactucasativaL􀆰)品种鉴定的操作程序、结 果统计与结果判定. 本文件适用于莴苣品种SSR指纹数据采集、数据库构建和品种鉴定. 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文 件. GB/T3543􀆰2农作物种子检验规程 扦样 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T2594植物品种鉴定 DNA分子标记法 总则 3 术语和定义 NY/T2594规定的术语和定义适用于本文件. 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件. APS:过硫酸铵(ammoniumpersulphate) bp:碱基对(basepair) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyGribonucleosidetriphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat) Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqGDNApolymerase) Tris:三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM) TE:三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(TrisGEDTA) TBE:三羟甲基氨基甲烷硼酸盐乙二胺四乙酸(TrisGborateGEDTA) TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N′,N′Gtetramethylethylenediamine) 5 原理 不同莴苣品种基因组中SSR的重复次数存在差异,这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测, 进而区分不同的莴苣品种. 6 主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂见附录A. 1NY/T4494—2025 7 溶液配制 溶液配制方法见附录B. 8 引物相关信息 引物名单及序列见附录C,引物相关信息见附录D. 9 参照品种 参照品种相关信息见附录E. 10 操作程序 10􀆰1 样品准备 送检样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官.样品需扦样时,应符合GB/T3543􀆰2的要求.每份样 品取不少于30个个体的叶片或其他等效物,混合分析,必要时进行个体检测. 10􀆰2 DNA提取 取幼苗或叶片200mg~300mg,置于2􀆰0mL离心管,加液氮充分研磨;每管加入600μL经65℃预 热的CTAB提取液,充分混合,65℃水浴45min~60min,其间多次轻缓颠倒混匀.每管加入与CTAB 提取液等体积的三氯甲烷和异戊醇混合液,轻缓混匀后静置10min,在12000r/min离心10min.吸取 上清液转移至新的离心管中,加入等体积预冷的异丙醇,轻轻颠倒混匀,-20℃放置30min,4℃、 12000r/min离心10min.弃上清液,用体积分数为70%的乙醇溶液洗涤2遍,晾干,加入100μL双蒸 水或TE缓冲液充分溶解,检测DNA浓度后4℃备用. 注1:以上为推荐的DNA提取方法,DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用.DNA溶液的紫 外吸光度OD260与OD280的比值宜介于1􀆰7~2􀆰0. 注2:三氯甲烷和异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为24∶1. 10􀆰3 PCR扩增 10􀆰3􀆰1 反应体系 PCR扩增反应体系的总体积和各组分的终浓度参照表1配制,可以依据试验条件调整.表1中的缓 冲液若含有氯化镁(MgCl2),不再加MgCl2溶液,加等体积双蒸水替代.利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)检测时选择普通引物;利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物,荧光标记位于上游引物5′ 端,推荐的荧光标记见附录D. 表1 PCR扩增反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 推荐加样体积,μL 10×缓冲液(含MgCl2) 10× 1× 2􀆰0 dNTPs 10mmol/L 0􀆰1mmol/L 0􀆰2 Taq酶 5U/μL 0􀆰05U/μL 0􀆰2 上游引物 10μmol/L 0􀆰25mmol/L 0􀆰5 下游引物 10μmol/L 0􀆰25mmol/L 0􀆰5 DNA 50ng/μL 5ng/μL 2􀆰0 双蒸水 — — 14􀆰6 总体积 20􀆰0 10􀆰3􀆰2 反应程序 推荐反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,共35个循环; 2NY/T4494—2025 72℃延伸10min,产物4℃保存.反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而做 适当的调整. 10􀆰4 PCR产物检测 10􀆰4􀆰1 变性PAGE 10􀆰4􀆰1􀆰1 制胶 用洗涤剂将玻璃板清洗干净,再用双蒸水、无水乙醇分别擦洗2遍.玻璃板干燥后,将0􀆰5mL亲和 硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上,将0􀆰5mL剥离硅烷工作液均匀涂在带凹槽的短玻璃板上.操作过程 中防止2块玻璃板互相污染.玻璃板彻底干燥后,将0􀆰4mm厚的塑料隔条整齐放在长玻璃板两侧,盖上 凹槽短玻璃板,用夹子固定,用水平仪检查玻璃胶室是否水平.配制8

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