2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 番 茄 品 种 鉴 定 S N P 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 4 9 3 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f t o m a t o v a r i e t i e s — S N P m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４４９３—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　主要仪器设备及试剂 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　溶液配制 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　引物信息及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　参照品种及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果判定与表述 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　主要仪器设备及试剂 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(规范性)　溶液配制 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(资料性)　引物序列及分型等信息 ６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４４９３—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利.本文件的发布机构不应承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、北京通州国际种业科技有限公司、北京市农林科学院蔬 菜研究所. 本文件主要起草人:韩瑞玺、王均帅、霍秀爱、张建、马莹雪、刘迎春、刘宝安、张凯淅、张秀杰、王晨宇、 温常龙、唐浩、冯艳芳、李嫒嫒、黄芳、王铭堂、刘雪景、庞雪兵. ⅡNY/T４４９３—２０２５ 番茄品种鉴定　SNP分子标记法 １　范围 本文件规定了利用单核苷酸多态性(SNP)标记进行番茄(SolanumlycopersicumL􀆰)品种鉴定的术语 和定义、缩略语、原理、主要仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息及使用、参照品种及使用、操作程序、结果 判定与表述. 本文件适用于番茄品种DNA分子数据采集和品种鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　扦样 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T２５９４　植物品种鉴定　DNA分子标记法　总则 ３　术语和定义 NY/T２５９４界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide). DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid). EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid). KASP:竞争性等位基因特异性PCR(kompetitiveallelespecificPCR). PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction). SNP:单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism). Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase). TE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ乙二胺四乙酸(TrisＧEDTA). Tris:三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM]. ５　原理 番茄品种的基因组中存在着能够世代稳定遗传的SNP位点.不同番茄品种在同一SNP位点的序列 可能存在差异,这种差异可通过PCR扩增、测序、高分辨率熔解曲线法、基因芯片等方法进行检测,进而区 分不同的品种.本文件推荐了基于KASP技术的荧光原位扫描检测方法. ６　主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂见附录A. ７　溶液配制 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T６６８２规定的一级水.溶液配制方 法见附录B. １NY/T４４９３—２０２５ ８　引物信息及使用 引物序列及分型等信息见附录C.可利用附录C中的引物序贯检测,当检测到的差异位点数能判定 送检样品与对照样品不同时,停止检测. ９　参照品种及使用 参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异,宜与送检样品同时检测. １０　操作程序 １０􀆰１　样品准备 送检样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官.种子样品需扦样时,应符合GB/T３５４３􀆰２的规定.每 份样品不少于３０个个体,等量混合分析,必要时进行个体检测. １０􀆰２　DNA提取 取混合样本约２００mg,置于２􀆰０mL圆底离心管中,经液氮冷冻后充分研磨;每管加入６００μL预热到 ６５℃的CTAB提取液,充分混合;６５℃水浴４５min~６０min,每隔１５min轻缓颠倒混匀１次.每管加入 与CTAB提取液等体积的三氯甲烷和异戊醇混合液,轻缓混匀后静置１０min,１２０００r/min离心１０min. 吸取上清液转移至新的离心管中,加入等体积预冷的异丙醇,轻轻颠倒混匀,－２０℃放置３０min,４℃、１２ ０００r/min离心１０min.弃上清液,用体积分数为７０％的乙醇溶液洗涤２遍,晾干,加入１００μL双蒸水或 TE缓冲液充分溶解,检测DNA浓度和质量,４℃备用. 注１:以上为推荐的DNA提取方法,DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用于本文件.DNA 溶液的紫外吸光度OD２６０与OD２８０的比值宜介于１􀆰７~２􀆰０. 注２:三氯甲烷和异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为２４∶１. １０􀆰３　SNP基因分型 １０􀆰３􀆰１　PCR扩增 １０􀆰３􀆰１􀆰１　反应体系 PCR反应可以在不同规格的PCR板或膜上进行,反应体系的总体积和各组分体积按照表１进行配 制,设置１个空白对照和２个参照样品. 表１　基于微孔板或微量反应孔膜平台的PCR反应体系 微孔板类型 ９６微孔板,μL ３８４微孔板,μL 微量反应孔膜,μL DNA模板(３０ng/μL) １􀆰５ １ ０􀆰８ ２×PCRMIX ５ ２􀆰５ ０􀆰７８ 引物工作液 ０􀆰１４ ０􀆰０７ ０􀆰０２ 双蒸水 ３􀆰３６ １􀆰４３ — 总反应体积 １０ ５ １􀆰６ 　　注:微量反应孔膜为DouglasArrayTape平台的反应体系,１５３６微孔板的反应体系参照微量反应孔膜配制. １０􀆰３􀆰１􀆰２　反应程序 a)　９５℃１０min; b)　９５℃１５s,５７℃６０s,４５次循环; c)　若初始反应结束检测不到荧光信号,可继续９５℃１５s,５７℃６０s,１０次~２０次循环. １０􀆰３􀆰２　荧光原位扫描 利用荧光原位扫描系统对PCR扩增产物进行基因分型,空白对照没有扩增信号或者扩增信号较弱, 且参照品种等位变异与附录C的等位变异一致时,采集基因分型数据. １０􀆰４　数据分析 １０􀆰４􀆰１　数据记录 ２NY/T４４９３—２０２５ 数据记录方式用SNP位点碱基符号表示基因型,如AA、TT、CC或GG,缺失数据记录为“—”.数据 质量需符合对应检测平台的质控要求. １０􀆰４􀆰２　数据比对及差异位点统计 逐一比对送检样品与对照样品每个位点的等位变异数据,按照位点相同、位点差异、数据缺失、无法判 定情形记录每个位点的比对结果,统计检测位点数和差异位点数. １１　结果判定与表述 １１􀆰１　判定规则 当差异位点数大于２,判定为“不同”;当差异位点数小于等于２,判定为“疑同”. １１􀆰２　结果表述 送检样品 与对照样品 (或对照样品 指纹)采用荧光原位扫描检测, 检测位点数为 ,差异位点数为 ,判定为 . ３NY/T４４９３—２０２５ 附　录　A (规范性) 主要仪器