2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 马 铃 薯 品 种 真 实 性 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 2 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 4 7 5 — 2 0 2 5 P o t a t o ( S o l a n u m t u b e r o s u m L . ) V a r i e t y g e n u i n e n e s s i d e n t i f i c a t i o n — S S R b a s e d m e t h o d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４４７５—２０２５ 目　　次 前言 Ⅳ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　检测方案 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　仪器设备、试剂和溶液配制 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　检测程序 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　鉴定意见 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　结果报告 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(资料性)　溶液配制 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(资料性)　２４对引物标记四色荧光的引物分组方法 １１ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(规范性)　等位变异扩增片段信息(毛细管电泳) １２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　参照样品及其等位变异信息 １５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４４７５—２０２５ 前　　言 按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草. 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利.本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC３７)归口. 本文件起草单位:全国农业技术推广服务中心、中国农业科学院蔬菜花卉研究所、农业农村部脱毒马 铃薯种薯质量监督检验测试中心(黑龙江)、云南师范大学薯类作物研究所、北京市农林科学院、中国农业 科学院作物科学研究所、深圳市农业科技促进中心、甘肃省种子总站、山西省农业种子总站、黑龙江省种业 技术服务中心 本文件主要起草人:金黎平、晋芳、胡军、卞春松、白艳菊、李灿辉、庞斌双、关荣霞、王学林、孟思远、李 巧英、肖长文、任雪贞、刘丰泽、金石桥. ⅡNY/T４４７５—２０２５ 　 　 　马铃薯品种真实性鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(simplesequencerepeat,SSR)分子标记法进行马铃薯(Solanum tuberosumL􀆰)品种真实性检测的原则、检测方案、检测程序和结果报告. 本文件适用于马铃薯品种真实性验证和品种真实性身份鉴定,不适用实质性派生品种(EssentialdeＧ rivedvarieties,EDV)的鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰１　农作物种子检验规程　总则 GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　扦样 GB/T３５４３􀆰５　农作物种子检验规程　真实性和品种纯度鉴定 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB７３３１　马铃薯种薯产地检疫规程 GB１８１３３　马铃薯种薯 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 品种真实性验证　varietyverification 与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实供检样品的品种名称与标注是否相符. ３􀆰２　 品种真实性身份鉴定　varietyidentification 经SSR分子标记检测并通过已知品种SSR指纹数据比对平台筛查比较,确定供检样品的真实品种 名称. ３􀆰３　 标准样品　standardsample 国家指定机构保存的代表品种特征特性的实物样品或DNA样品. ３􀆰４　 SSR指纹数据比对平台　SSRfingerprintblastplatform 采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品的等位变异进行检测,并运用计算机数据库技术和网络 信息技术所构建的品种分子数据信息的检索比对载体. ３􀆰５　 参照样品　referencesample 具有SSR位点上主要等位变异的品种,用于辅助确定试验样品的等位变异,校正仪器设备的系统 误差. ３􀆰６　 引物组合　primerpanel １NY/T４４７５—２０２５ 用来最大能力区分马铃薯品种的所有引物的集合. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(basepair) CTAB:cetyltrimethylammoniumbromide十六烷基三甲基溴化铵 DNA:deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸 dNTPs:deoxyＧribonucleosidetriphosphates脱氧核糖核苷三磷酸 PAGE:polyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR:polymerasechainreaction聚合酶链式反应 SDS:sodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠 SSR:simplesequencerepeat简单重复序列 EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸 TBE:TrisＧBorateＧEDTA三羟甲基氨基甲烷Ｇ硼酸盐Ｇ乙二胺四乙酸二钠 Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷 PVP:Polyvinyl－pyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮 Taq酶:TaqＧDNApolymerase耐热DNA聚合酶 ５　原理 马铃薯不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR)的重复次数差异.这种差 异可以通过从试验样品中提取DNA,用SSR引物进行扩增和电泳,从而利用扩增片段大小不同而区分 品种. 依据SSR标记检测原理,采用SSR引物,通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台比对的方 式,对品种真实性进行验证或身份鉴定.真实性验证依据SSR位点差异数目而判定,品种真实性身份鉴 定依据被检SSR位点无差异原则进行筛查、鉴定. ６　检测方案 ６􀆰１　总则 对于真实性鉴定,引物、检测平台、样品状况不同,其检测结果的准确度、精确度可能有所不同.应依 据“适于检测目的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,择定适宜的引物、检测平台、样品状况,制订相 应的检测方案. 在严格控制条件下,合成选择的引物,按照确定的检测平台对供检样品按DNA提取、PCR扩增、电 泳、数据分析的程序进行检测. 按规定要求填报检测结果,检测报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息. DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下,按照检 测平台的要求允许对本标准的规定做适宜的调整. ６􀆰２　检测平台 ６􀆰２􀆰１　对于马铃薯品种真实性验证或身份鉴定,可选择采用变性PAGE垂直板电泳或毛细管电泳,如 需要利用SSR指纹数据比对平台,则需要利用参照样品确定供检样品的指纹后,再进行真实性身份 鉴定. ６􀆰２􀆰２　对于样品数量较大的,可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增仪、毛 细管电泳进行组合,以提高检测的综合效率. ６􀆰３　引物 遴选了２４对SSR引物作为品种真实性验证和身份鉴定的引物,具体见表１,引物编号为St０１~St２４. ２NY/T４４７５—２０２５ 表１　引物信息 编号引物名称染色体 上游引物序列(５′Ｇ３′) 下游引物序列(５′Ｇ３′) St０１STM１０４９b１ CTACCAGTTTGTTGATTGTGGTG AGGGACTTTAATTTGTTGGACG St０２ S７a２ GACTGGCTGACCCTGAACTC GACAAAATTACAGGAACTGCAAA St０３ S１９２a３ ACTTCTGCATCTGGTG