2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 水 稻 品 种 及 其 实 质 性 派 生 品 种 鉴 定 M N P 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 4 5 9 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f r i c e v a r i e t i e s a n d t h e i r e s s e n t i a l l y d e r i v e d v a r i e t i e s — M N P m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４４５９—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　试剂和材料 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　仪器设备 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　质量控制 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　数据分析 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　结果判定 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　MNP标记和标记检测引物 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(资料性)　品种鉴定流程示例 ７９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４４５９—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:江汉大学、农业农村部科技发展中心、武汉明了生物技术有限公司、湖北省农业科学 院、湖南杂交水稻研究中心、崖州湾分子检测鉴定中心、深圳华大智造科技股份有限公司、深圳市真迈生物 科技有限公司. 本文件主要起草人:彭海、韩瑞玺、方治伟、周俊飞、荆若男、李甜甜、李论、高利芬、陈利红、万人静、张 静、游艾青、刘凯、徐华山、李莉、许娜、宋书锋、包晓东、余进文、颜钦. ⅡNY/T４４５９—２０２５ 水稻品种及其实质性派生品种鉴定 MNP标记法 １　范围 本文件规定了利用多核苷酸多态性(MultipleNucleotidePolymorphism,MNP)标记进行水稻(OryＧ zasativaL􀆰)品种鉴定及其实质性派生品种鉴定的术语和定义、原理、主要仪器设备及试剂、引物相关信 息、操作程序、数据分析、结果判定与表述. 本文件适用于水稻品种鉴定及其实质性派生品种的鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检测规程扦样 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T３８５５１—２０２０　植物品种鉴定　MNP标记法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 多核苷酸多态性　multiplenucleotidepolymorphism,MNP 在一段核苷酸序列中,由一个或多个核苷酸变异引起的序列多态性. [来源:GB/T３８５５１,３􀆰１,有修改] ３􀆰２ 实质性派生品种　essentiallyderivedvariety,EDV 由原始品种实质性派生,或者由该原始品种的实质性派生品种派生出来的品种,与原始品种有明显区 别,并且除派生引起的性状差异外,在表达由原始品种基因型或者基因型组合产生的基本性状方面与原始 品种相同. [来源:«中华人民共和国种子法»,第九十条第十款] ３􀆰３ 平均覆盖倍数　averagecoverage 在基因组上比对到所有标记位点上的所有测序片段的总数与标记位点总数的比值. [来源:GB/T３８５５１—２０２０,３􀆰４,有修改] ３􀆰４ 检出标记位点　detectedmarkers 至少有一个等位基因型且有２０条及以上测序片段支持的标记位点. [来源:GB/T３８５５１—２０２０,３􀆰５,有修改] ４　原理 水稻品种及其实质性派生品种的基因组中存在着能够世代稳定遗传的MNP位点.利用多重聚合酶 链式反应(PCR)、二代高通量测序以及生物信息学方法扩增、检测和分析品种MNP标记,获得MNP标记 １NY/T４４５９—２０２５ 基因型及其在品种间的遗传差异,计算品种间遗传相似度,获得品种鉴定结论和实质性派生品种鉴定 结论. ５　试剂和材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂,实验用水符合GB/T６６８２中规定的一级水的要求. ５􀆰１　多重PCR扩增与文库构建试剂盒 应匹配MNP标记和标记检测引物,以及高通量测序试剂盒. ５􀆰２　高通量测序试剂盒 应匹配高通量测序仪. ５􀆰３　MNP标记和标记检测引物 应符合附录A的要求. ６　仪器设备 ６􀆰１　离心机 最大转速度不小于１２０００r/min. ６􀆰２　电泳仪 ６􀆰３　PCR扩增仪 ６􀆰４　高通量测序仪 测序总读长不低于３００bp. ６􀆰５　计算机服务器 ７　操作程序 ７􀆰１　样品准备 送检样品宜为种子、幼苗、叶片、穗子等组织或器官. 送检样品抽取的样本数量宜为３０个以上. 样品需扦样时,应符合GB/T３５４３􀆰２的要求. 抽取的样本可以混合后检测或单个个体检测. ７􀆰２　DNA提取 利用核酸提取试剂提取待测样品DNA.提取的DNA在２６０nm与２３０nm处的吸光度值的比值大 于２􀆰０,２６０nm与２８０nm吸光度比值介于１􀆰７~１􀆰９. ７􀆰３　多重PCR扩增与文库构建 按多重PCR扩增与文库构建试剂盒的说明书进行DNA质控、多重PCR扩增、文库构建与纯化.其 中,多重PCR的扩增循环数不高于２０次. ７􀆰４　高通量测序 按高通量测序试剂盒和高通量测序仪的操作说明,对７􀆰３中获得的高通量测序文库进行高通量测序. 高通量测序时标记位点的平均覆盖倍数宜设置为７００倍以上,测序片段总读长不小于３００bp. ８　质量控制 ８􀆰１　环境 样品准备、DNA提取、多重PCR扩增、文库构建和高通量测序宜在规定的区域或相互隔离的区域按 单一方向进行操作,不同区域的仪器设备需专用. ８􀆰２　测序数据 ８􀆰２􀆰１　高通量测序原始数据质量应满足所采用的高通量测序仪的操作手册中所规定的测序质量要求. ２NY/T４４５９—２０２５ ８􀆰２􀆰２　将样品的测序数据比对到参考基因组的标记位点上,统计第一次检测的标记位点的平均覆盖倍数 C１. ８􀆰２􀆰３　当C１小于５００时,判定样品的测序数据量不足,从７􀆰４或之前的步骤开始重新实验至第一次检测 的标记位点的平均覆盖倍数C１大于或等于５００. ８􀆰２􀆰４　当C１大于或等于５００时,进一步计算检出标记位点的比例R１.R１按公式(１)计算. R１＝T１ T×１００ (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: R１———样品检出标记位点百分率的数值,单位为百分号(％); T１———样品检出标记位点的数目; T———样品检测标记位点的数目. ８􀆰２􀆰５　当R１大于或等于９５％时,判定测序数据合格;否则,从７􀆰２或之前的步骤重新实验至第二次检出 的标记位点的平均覆盖倍数C２大于或等于５００. ８􀆰２􀆰６　当C２大于或等于５００时,进一步计算第一次和第二次共同检出的标记位点的比例R２.R２按公 式(２)计算. R２＝２T１２ T１１＋T２×１００ (２) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: R２———第一次和第二次共同检出的标记位点百分率的数值,单位为百分号(％); T１２———第一次和第二次共同检出标记位点的数目; T１１———第一次检出标记位点的数目; T２———第二次检出标记位点的数目. ８􀆰２􀆰７　当R２大于或等于９５％时,判定测序数据合格. 注:附录B提供了一个操作案例,其他满足DNA提取、文库制备和高通量测序的试剂、仪器设备均可;样品不要求必须 重复检测２次,但重复检测有助于减少样品编号、PCR扩增、测序过程中的随机错误. ９　数据分析 ９􀆰１　测序数据比对与记录 ９􀆰１􀆰１　将测序数