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2 0 2 3 1 2 2 2 发 布 - - 2 0 2 4 0 5 0 1 - - 实 施 畜 肉 中 龙 胆 紫 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 4 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 : X X X X - X X X X I C S 6 7 . 1 2 0 . 1 0 C C S B 4 4 3 7 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f c r y s t a l v i o l e t i n l i v e s t o c k m e a t — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y w i t h t a n d e m - m a s s s p e c t r o m e t r y m e t h o d N Y / T 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T4437—2023 前  言 本文件按照GB/T1􀆰1—2020«标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国屠宰加工标准化技术委员会(SAC/TC516)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院农产品加工研究所、北京市农产品质量安全中心、赤峰市动物疫病 预防控制中心、安徽省兽药饲料监察所、食药环检验研究院(山东)集团有限公司、日照高新区河山镇农业 综合服务中心、海南省动物疫病预防控制中心、北京市畜牧总站、苏州市动物疫病预防控制中心、山东百脉 泉酒业股份有限公司、北京英太格瑞检测技术有限公司、济南市历城区综合检验检测中心. 本文件主要起草人:单吉浩、温雅君、斯琴图雅、吴昊、刘莹莹、刘伟、刘发全、胡明霞、李庆霞、杨信、徐 迪、李建勋、李复煌、顾津僮、毕言锋、卢培培、叶丰、何月新、周晓倩、徐宏、汪慧慧、马少红. ⅠNY/T4437—2023 畜肉中龙胆紫的测定 液相色谱G串联质谱法 1 范围 本文件描述了畜肉中龙胆紫及其分解物隐性龙胆紫的液相色谱G串联质谱测定方法. 本文件适用于猪肉、牛肉、羊肉、驴肉和马肉中龙胆紫及其分解物隐性龙胆紫的测定. 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. 4 原理 试样中的龙胆紫及其分解物隐性龙胆紫用乙腈提取,经混合阳离子固相柱净化,液相色谱G串联质谱 仪测定,内标法定量. 5 试剂和材料 除非另有规定,在分析中仅使用分析纯试剂,水为符合GB/T6682规定的一级水. 5􀆰1 试剂 5􀆰1􀆰1 乙腈(CH3CN):色谱纯. 5􀆰1􀆰2 甲酸(HCOOH):色谱纯. 5􀆰1􀆰3 甲醇(CH3OH). 5􀆰1􀆰4 乙酸铵(CH3COONH4):色谱纯. 5􀆰1􀆰5 乙酸(CH3COOH). 5􀆰2 溶液的配制 5􀆰2􀆰1 2%甲酸溶液:取2mL甲酸(5􀆰1􀆰2),用水稀释至100mL. 5􀆰2􀆰2 2%甲酸G乙腈溶液:取2mL甲酸(5􀆰1􀆰2),用乙腈(5􀆰1􀆰1)稀释至100mL. 5􀆰2􀆰3 乙酸铵溶液(5mmol/L,pH7􀆰0):取0􀆰38g乙酸铵,用水溶解并稀释至900mL,用乙酸(5􀆰1􀆰5) 调pH至7􀆰0,用水稀释至1000mL. 5􀆰2􀆰4 5%乙酸铵G甲醇溶液:取5mL乙酸铵溶液(5􀆰2􀆰3),用甲醇(5􀆰1􀆰3)稀释至100mL. 5􀆰2􀆰5 乙酸铵G乙腈溶液:取100mL乙酸铵溶液(5􀆰2􀆰3),加100mL乙腈(5􀆰1􀆰1). 5􀆰2􀆰6 0􀆰1%甲酸G乙酸铵溶液:取1mL甲酸(5􀆰1􀆰2),用乙酸铵溶液(5􀆰2􀆰3)稀释至1000mL. 5􀆰2􀆰7 0􀆰1%甲酸G乙腈溶液:取1mL甲酸(5􀆰1􀆰2),用乙腈溶液(5􀆰1􀆰1)稀释至1000mL. 5􀆰3 标准品 龙胆紫和隐性龙胆紫及2种同位素内标物标准品:纯度≥97%,中英文名称、CAS号、分子式见附 录A. 5􀆰4 标准溶液的制备 1NY/T4437—2023 5􀆰4􀆰1 混合标准储备溶液(1mg/mL):分别称取各10mg(精确至0􀆰1mg)龙胆紫标准品和隐性龙胆紫 标准品,用乙腈(5􀆰1􀆰1)溶解并定容至10mL棕色容量瓶中,配制成浓度为1mg/mL的混合标准储备溶 液,于-18℃以下避光保存,有效期6个月. 5􀆰4􀆰2 混合标准中间溶液(10μg/mL):准确移取0􀆰1mL混合标准储备溶液(5􀆰4􀆰1),用乙腈(5􀆰1􀆰1)稀 释并定容至10mL棕色容量瓶中,配制成浓度为10μg/mL的混合标准中间溶液,于-18℃以下避光保 存,有效期3个月. 5􀆰4􀆰3 混合标准工作溶液(100ng/mL):准确移取0􀆰1mL混合标准中间溶液(5􀆰4􀆰2),用乙腈(5􀆰1􀆰1) 稀释并定容至10mL棕色容量瓶中,于0℃~4℃避光保存,有效期1个月. 5􀆰4􀆰4 混合同位素内标标准储备溶液(1mg/mL):分别称取各10mg(精确至0􀆰1mg)龙胆紫GD6标准品 和隐性龙胆紫GD6标准品(5􀆰3),用乙腈(5􀆰1􀆰1)溶解并定容至10mL棕色容量瓶中,配制成浓度为1mg/ mL的混合同位素内标标准储备溶液,于-18℃以下避光保存,有效期6个月. 5􀆰4􀆰5 混合同位素内标标准中间溶液(10μg/mL):准确移取0􀆰1mL混合同位素内标标准储备溶液 (5􀆰4􀆰4),用乙腈(5􀆰1􀆰1)稀释并定容至10mL棕色容量瓶中,配制成浓度为10μg/mL的混合同位素内 标标准中间溶液,于-18℃以下避光保存,有效期3个月. 5􀆰4􀆰6 混合同位素内标标准工作溶液(100ng/mL):准确移取0􀆰1mL混合同位素内标标准中间溶液 (5􀆰4􀆰5),用乙腈(5􀆰1􀆰1)稀释并定容至10mL棕色容量瓶中,配制成浓度为100ng/mL的混合同位素内 标标准工作溶液,于0℃~4℃避光保存,有效期1个月. 5􀆰5 材料 5􀆰5􀆰1 陶瓷均质子. 5􀆰5􀆰2 混合阳离子固相萃取小柱:60mg/3mL,或相当者. 5􀆰5􀆰3 微孔滤膜:0􀆰22μm,有机系. 6 仪器设备 6􀆰1 液相色谱G串联质谱仪:配电喷雾离子源(ESI). 6􀆰2 天平:感量0􀆰01g和0􀆰00001g. 6􀆰3 pH计. 6􀆰4 涡旋振荡器. 6􀆰5 超声波仪. 6􀆰6 离心机:转速≥8000r/min,温度可调范围0℃~4℃. 6􀆰7 固相萃取装置. 6􀆰8 氮吹仪. 7 试样的制备与保存 7􀆰1 试样制备 取适量新鲜或解冻的空白或供试组织,绞碎,并使均质. a) 取均质后的供试样品,作为供试试样; b) 取均质后的空白样品,作为空白试样; c) 取均质后的空白样品,添加适宜浓度的混合标准工作溶液,作为空白添加试样. 7􀆰2 试样保存 -18℃以下保存. 8 测定步骤 8􀆰1 提取 2NY/T4437—2023 称取5g试样(精确至±0􀆰05g)于50mL具塞离心管内,加入2粒陶瓷均质子,加10mL乙腈 (5􀆰1􀆰1)和200μL混合同位素内标标准工作溶液(5􀆰4􀆰6),加盖涡旋振荡5min,用超声波仪超声10min, 5000r/min低温(0℃~4℃)离心5min,上清液转移至25mL的比色管中;再向离心管中加入10mL乙 腈(5􀆰1􀆰1),涡旋振荡5min,重复上述超声提取和离心,将上清液合并至同一比色管中,用乙腈(5􀆰1􀆰1)定 容至25􀆰0mL,摇匀,作为备用液. 8􀆰2 净化 取混合阳离子固相萃取小柱,依次用3mL乙腈(5􀆰1􀆰1)和3mL2%的甲酸溶液(5􀆰2􀆰1)活化.移取 5􀆰00mL上述备用液过混合阳离子固相萃取小柱,依次用2mL2%甲酸G乙腈溶液(5􀆰2􀆰2)和6mL乙腈 (5􀆰1􀆰1)淋洗混合阳离子固相萃取小柱,弃去流出液,抽干,用4mL5%乙酸铵G甲醇溶液(5􀆰2􀆰4)洗脱. 过柱流速控制为1mL/min,收集洗脱液,45℃下氮气吹至干后,加2􀆰0mL乙酸铵G乙腈溶液(5􀆰2􀆰5)溶 解,涡旋混匀,过0􀆰22μm滤膜后供液相色谱G串联质谱仪测定. 8􀆰3 标准曲线的制备 准确移取混合标准工作溶液(5􀆰4􀆰3)和混合同位素内标标准工作溶液(5􀆰4􀆰6)适量,用乙酸铵G乙腈溶 液(5􀆰2􀆰5)稀释,配制成龙胆紫和隐性龙胆紫浓度分别为0􀆰5μg/L、1􀆰0μg/L、2􀆰0μg/L、10μg/L和 50μg/L(2种同位素内标物浓度均为2μg/L)的系列标准溶液,临用现配,供液相色谱G串联质谱仪测定. 以标准物特征离子色谱峰的峰面积与同位素内标物特征离子色谱峰的峰面积比值为纵坐标、相应的标准 溶液浓度为横坐标、绘制标准工作曲线,求回归方程和相关系数. 8􀆰4 测定 8􀆰4􀆰1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a) 色谱柱:C18柱(100mm×2􀆰1mm,粒径2􀆰7μm),或相当者; b) 流动相A为0􀆰1%甲酸G乙腈溶液(5􀆰2􀆰7),流动相B为0􀆰1%甲酸G乙酸铵溶液(5􀆰2􀆰6),梯度洗 脱条件见表1; c) 流速:0􀆰4mL/min; d) 柱温:40℃; e) 进样量:2μL. 表1 液相色谱梯度洗脱条件 时间,min 0􀆰1%甲酸G乙腈,% 0􀆰1%甲酸G乙酸铵溶液,% 0 10 90

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