2 0 2 3 0 4 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 8 0 1 － － 实 施 畜 禽 固 体 粪 污 中 1 3 9 种 药 物 残 留 的 测 定 液 相 色 谱 - 高 分 辨 质 谱 法 4 0 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 8 0 C C S B 4 3 6 4 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f 1 3 9 d r u g r e s i d u e s i n f a e c e s o f l i v e s t o c k a n d p o u l t r y s o l i d m a n u r e — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - h i g h r e s o l u t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３６４—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC２７４)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所. 本文件主要起草人:徐贞贞、王雪、杨曙明、陈爱亮、王珂雯、李会. ⅠNY/T４３６４—２０２３ 畜禽固体粪污中１３９种药物残留的测定 液相色谱Ｇ高分辨质谱法 １　范围 本文件描述了畜禽固体粪污中１３９种药物残留的液相色谱Ｇ高分辨质谱测定方法. 本文件适用于畜禽固体粪污中１３９种药物残留的定性. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２５１６９　畜禽粪便监测技术规范 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 畜禽固体粪污　livestockandpoultrysolidmanure 畜禽养殖过程中产生的粪、尿、外漏饮水和冲洗水及少量散落饲料等组成的固态混物. 注:一般指干物质(DM)含量≥１５％的畜禽粪污. ４　原理 畜禽固体粪污中的药物残留用Na２EDTAＧMcIIvaine缓冲液和乙腈提取,经QuEChERS方法净化, 用液相色谱Ｇ高分辨质谱仪定性,基质匹配标准溶液校准,外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有说明,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:GB/T６６８２,一级水. ５􀆰２　甲醇:色谱纯. ５􀆰３　乙腈:色谱纯. ５􀆰４　５０％甲醇溶液:取１０mL甲醇,用水溶解并稀释至２０mL. ５􀆰５　流动相A:称取０􀆰１５g乙酸铵,置于１０００mL容量瓶中,用水溶解,再加２mL甲酸,并用水定容,混匀. ５􀆰６　流动相B:准确量取２mL甲酸,用甲醇稀释至１０００mL. ５􀆰７　Na２EDTAＧMcIIvaine缓冲液:分别称取无水磷酸氢二钠１０􀆰９g,乙二胺四乙酸二钠３g,柠檬酸 １２􀆰９g,加水溶解并稀释至１０００mL. ５􀆰８　混合标准储备溶液(１００μg/mL):分别精密称取标准品适量,并用其指出的溶剂配制成８组混合标 准储备溶液(见附录A).其中,A组(２０种)、B组(１５种)、C组(８种)、D组(８种)、E组(２种)、F组(５ 种)、G组(２种)、H组(１３种).A组、B组、C组、D组、G组、H组６组标准储备溶液置于－２０℃以下避 光保存,有效期为１２个月;其他２组标准储备溶液置于－２０℃以下避光保存,有效期为２个月.或购买 商品化有证标准储备溶液. ５􀆰９　混合标准中间溶液(１μg/mL):准确量取各组混合标准储备溶液(５􀆰８)１００μL,用５０％甲醇溶液 １NY/T４３６４—２０２３ (５􀆰４)稀释,混匀.临用现配. ５􀆰１０　混合标准系列工作溶液:准确量取混合标准中间溶液(５􀆰９)适量,置于１０mL容量瓶中,用５０％甲 醇溶液(５􀆰４)稀释成２ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL、２０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL混合标准系列工作 溶液,混匀.临用现配. ５􀆰１１　QuEChERS盐析包:每份含４g硫酸钠及１g氯化钠. ５􀆰１２　QuEChERS除脂分散净化剂:每份含１g净化剂或性能相当的产品. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱Ｇ高分辨质谱仪:配有电喷雾离子源的飞行时间质谱. ６􀆰２　分析天平:精度为０􀆰０１mg和０􀆰０１g. ６􀆰３　涡旋混合仪. ６􀆰４　离心机:转速不低于９５００r/min. ６􀆰５　氮吹仪. ６􀆰６　冷冻干燥机. ６􀆰７　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ７　样品 ７􀆰１　试样制备 采样地点及采样量按照GB/T２５１６９畜禽粪便监测技术规范进行(不做加酸处理).所采集的畜禽固 体粪污样品采用冷冻干燥至恒重(２次称重值之差≤１０mg),经研磨过２mm分析筛,再细磨过０􀆰２５mm 分析筛制成制备样.常温干燥避光保存. ７􀆰２　基质空白试样 选取混合程度较高、待测物保留时间处仪器响应值应小于定量限对应响应值的３０％的畜禽固体粪污 作为基质空白样品. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 平行做２份试验.准确称取试样２g(精确到０􀆰０１g),置于５０mL离心管中,加入８mLNa２EDTAＧ McIIvaine缓冲液(５􀆰７),涡旋混匀,再加入１０􀆰０mL乙腈(V１),涡旋１min后加入１份萃取盐包(５􀆰１１), 静置１０min使盐析分层,９５００r/min条件下离心１０min,准确量取８mL的上层清液(V２)于１５mL离心 管中,在４０℃下,氮气吹干,用２mL乙腈复溶,备用. ８􀆰２　净化 称取０􀆰５g除脂分散净化剂(５􀆰１２)于１５mL净化管,加入２mL水,混匀、涡旋２min后,将上述２mL 备用复溶液(８􀆰１)全部转移至净化管中得到４mL净化溶液(V３),涡旋１min,在９５００r/min条件下离心 ５min,上清液过滤膜,供液相色谱Ｇ高分辨质谱仪分析测定. ８􀆰３　基质匹配混合标准系列溶液的制备 取若干份空白试样,按“８􀆰１”和“８􀆰２”处理,制备空白试样溶液,准备量取混合标准系列工作溶液 (５􀆰１０)各１mL,氮气吹干后,用空白试样溶液１mL稀释,混匀.供液相色谱Ｇ高分辨质谱仪测定. ８􀆰４　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:C１８柱,柱长１５０mm,内径３􀆰０mm,粒径１􀆰８μm,或性能相当者; b)　柱温:４０℃; c)　流速:０􀆰４mL/min; ２NY/T４３６４—２０２３ d)　进样量:２μL; e)　梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序 时间,min 流动相A,％ 流动相B,％ ０ ９５ ５ ０􀆰５ ９５ ５ ３􀆰０ ８５ １５ １０􀆰０ ６０ ４０ １８􀆰０ ０ １００ ２３􀆰０ ０ １００ ２３􀆰１ ９５ ５ ２６􀆰０ ９５ ５ ８􀆰５　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　离子源:电喷雾离子源; b)　扫描方式:正离子模式(ESI＋); c)　碎裂电压:１２５V; d)　干燥气温度:２５０℃; e)　雾化气压力:２４１􀆰３１５kPa; f)　毛细管电压:３０００V; g)　采集模式:全扫描(ScanMS)及二级离子扫描(TargetMS/MS); h)　ScanMS模式监控窗口:相对质量偏差≤１０×１０－６(１０ppm),扫描范围:５０m/z~１３００m/z; i)　TargetMS/MS模式监控窗口:相对质量偏差≤１５×１０－６(１５ppm),扫描范围:５０m/z~ １０００m/z; j)　采集频率:２spectra/s. ８􀆰６　高分辨质谱谱库构建 输入１３９种药物的中英文名称、CAS号及化学式,由高分辨质谱谱库构建软件计算得到每个标准品 的理论质量数.采用１００ng/mL的混合标准工作溶液在全扫描(ScanMS)模式下进行测定,得到每个药 物的保留时间和母离子精确质量数测定值;在二级离子扫描(TargetMS/MS)模式下,对每种药物进行碎 片离子谱图采集,并将其导入高分辨质谱谱库,与相应药物的保留时间(见附录B)、精确质量数测定值、中 英文名称、CAS号、分子式等信息相关联,完成谱库构建. ８􀆰７　鉴别 筛选分析依据全扫描(ScanMS)模式下保留时间及精确质量数测定值.如检出的色谱峰保留时间与 谱库中的保留时间偏差在±２􀆰５％,且母离子测定精确质量数与理论质量数的相对偏差小于或等于５× １０－６(５ppm),则可以初步判断试样中含有该种药物. ８􀆰８　确认 对于初步鉴别出的阳性药物,在二级离子扫描(TargetMS/MS)下检测其在不同碰撞能下典型的二 级碎片离子(见附录C),如果至少有２个及以上丰度较高的碎片离子测定精确质量数与谱库中相应碎片 离子质量数相对偏差小于或等于１０×１０－６(１０ppm),且上述二级碎片离子与浓度接近的标准工作液中对 应的碎片离子的相对丰度一致,即偏差不超过表２规定的范围,且平行试验结果一致的情况下,可判定为 试样中存在这种药物. 表２　确证分析时相对离子丰度的最大允许相对偏差 相对离子丰度 ＞５０％ ＞２０％至５０％