2 0 2 3 0 4 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 8 0 1 － － 实 施 饲 料 添 加 剂 α - 半 乳 糖 苷 酶 活 力 的 测 定 分 光 光 度 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 3 6 1 — 2 0 2 3 F e e d a d d i t i v e s — D e t e r m i n a t i o n o f α - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y — S p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３６１—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:武汉新华扬生物股份有限公司、全国畜牧总站. 本文件主要起草人:詹志春、粟胜兰、徐丽、周樱、苏丹、陈雪姣、邓晓旭、程瑛. ⅠNY/T４３６１—２０２３ 饲料添加剂　αＧ半乳糖苷酶活力的测定 分光光度法 １　范围 本文件描述了饲料添加剂αＧ半乳糖苷酶活力的分光光度测定方法. 本文件适用于饲料添加剂αＧ半乳糖苷酶及其混合型饲料添加剂酶制剂中αＧ半乳糖苷酶活力的测定. 本文件的定量限为１０U/g(或U/mL). ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅 该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 αＧ半乳糖苷酶活力单位　αＧgalactosidaseactivityunit 在３７℃、pH５􀆰５的条件下,每分钟从浓度为５mmol/L的对硝基苯基ＧαＧDＧ吡喃半乳糖苷溶液中释放 １μmol对硝基苯酚所需要的酶量. 注:酶活力单位为U. ４　原理 在一定温度和pH条件下,αＧ半乳糖苷酶分解对硝基苯基ＧαＧDＧ吡喃半乳糖苷为αＧDＧ吡喃半乳糖和对 硝基苯酚.对硝基苯酚在碳酸钠溶液中呈黄色,反应液的吸光值与酶解产生的对硝基苯酚的量成正比,采 用分光光度法测定反应液吸光值,计算αＧ半乳糖苷酶活力. ５　试剂或材料 除非另有说明,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:GB/T６６８２,三级. ５􀆰２　碳酸钠溶液(０􀆰２mol/L):称取２１􀆰２０g无水碳酸钠,加水溶解,定容至１０００mL. ５􀆰３　乙酸溶液(０􀆰１mol/L):吸取冰乙酸０􀆰６０mL,加水定容至１００mL,摇匀. ５􀆰４　乙酸钠溶液(０􀆰１mol/L):称取无水乙酸钠０􀆰８２g,加水溶解,定容至１００mL. ５􀆰５　乙酸Ｇ乙酸钠缓冲液(０􀆰１mol/L):称取无水乙酸钠８􀆰２g,加水约９００mL溶解,用乙酸溶液(５􀆰３)或 乙酸钠溶液(５􀆰４)调节pH至５􀆰５０±０􀆰０１,定容至１０００mL. ５􀆰６　对硝基苯基ＧαＧDＧ吡喃半乳糖苷溶液(１０mmol/L):称取对硝基苯基ＧαＧDＧ吡喃半乳糖苷(化学式 C１２H１５NO８,相对分子质量３０１􀆰２５,纯度９９％,SigmaN０８７７或上海扶生M３２１３９１))０􀆰３０１g,用８０mL乙 酸Ｇ乙酸钠缓冲液(５􀆰５)溶解,定容至１００mL.－１８℃避光保存,有效期２个月. 　　１)　SigmaN０８７７和上海扶生M３２１３９是商品名,给出这一信息是为了给本文件的使用者一个相对标准,并不表示对该产品的认可. 如果其他产品能有相同的效果,则可使用这些等效的产品.５􀆰７　对硝基苯酚标准储备溶液(２０μmol/mL):准确称取对硝基苯酚０􀆰１３９g,加入４０mL碳酸钠溶液 １NY/T４３６１—２０２３ (５􀆰２),溶解,定容至５０mL,临用现配. ５􀆰８　对硝基苯酚标准溶液(１μmol/mL):吸取对硝基苯酚标准储备溶液(５􀆰７)５mL,用碳酸钠溶液(５􀆰２) 稀释定容至１００mL,临用现配. ６　仪器设备 ６􀆰１　紫外可见分光光度计:波长准确度为±１nm,可在４００nm处比色. ６􀆰２　分析天平:精度为０􀆰０００１g. ６􀆰３　pH计:精确至０􀆰０１. ６􀆰４　涡旋混合器. ６􀆰５　恒温振荡器:精度为１􀆰０℃. ６􀆰６　恒温水浴锅:精度为０􀆰１℃. ６􀆰７　秒表. ６􀆰８　恒温磁力搅拌器. ６􀆰９　离心机:转速在４０００r/min以上. ７　样品 按照GB/T２０１９５的规定制备样品,至少２００g(或２００mL),固态样品应全部通过０􀆰４２mm孔径的 分析筛.充分混匀,装入磨口瓶中,密闭保存,备用. ８　试验步骤 ８􀆰１　标准曲线绘制 取１０mL试管按表１加入相关溶液(每个浓度２个平行),混合,静止显色５min,以０号试管试液作 为标准空白溶液,在４００nm波长下测定其他试管的吸光度.以对硝基苯酚的量为Y轴、吸光度为X轴, 绘制标准曲线,R２达到０􀆰９９以上. 表１　标准曲线的制作 试管号 ０ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ 对硝基苯酚标准溶液,μL ０ ３０ ６０ ９０ １２０ １５０ １８０ ２１０ 乙酸Ｇ乙酸钠缓冲液,μL １０００ ９７０ ９４０ ９１０ ８８０ ８５０ ８２０ ７９０ 碳酸钠溶液,mL ４ ４ ４ ４ ４ ４ ４ ４ 对硝基苯酚的量,μmol ０ ０􀆰０３ ０􀆰０６ ０􀆰０９ ０􀆰１２ ０􀆰１５ ０􀆰１８ ０􀆰２１ ８􀆰２　试样溶液的制备 ８􀆰２􀆰１　固态试样溶液的制备 平行做２份试验.称取０􀆰２g~１g试样,精确至０􀆰０００１g,置于锥形瓶中,准确加入１００mL乙酸Ｇ乙 酸钠缓冲液(５􀆰５).置于(２５±３)℃恒温振荡器或恒温磁力搅拌器中提取,不低于１４０r/min振荡或搅拌 ３０min,静置１０min,离心或过滤,取上清液或滤液,用乙酸Ｇ乙酸钠缓冲液(５􀆰５)进行稀释,稀释后待测酶 液中αＧ半乳糖苷酶活力控制在０􀆰０１２U/mL~０􀆰０３U/mL. ８􀆰２􀆰２　液态试样溶液的制备 平行做２份试验.移取０􀆰２mL~１mL试样,用乙酸Ｇ乙酸钠缓冲液(５􀆰５)进行稀释、定容,稀释后 的待测酶液中αＧ半乳糖苷酶活力控制在０􀆰０１２U/mL~０􀆰０３U/mL.如果稀释后酶液的pH偏离 ５􀆰５０,应用乙酸溶液(５􀆰３)或乙酸钠溶液(５􀆰４)调整校正pH至５􀆰５０,再用乙酸Ｇ乙酸钠缓冲液(５􀆰５)适 当稀释并定容. ８􀆰３　测定 吸取试样溶液０􀆰５０mL,置于１０mL试管中,３７℃平衡５min.加碳酸钠溶液(５􀆰２)４􀆰０mL,涡旋 ２NY/T４３６１—２０２３ ３s,３７℃保温１０min,加入经３７℃平衡的对硝基苯基ＧαＧDＧ吡喃半乳糖苷(５􀆰６)０􀆰５０mL,混匀.显色 ５min.以标准空白溶液(８􀆰１)为空白对照,在４００nm波长处测定吸光度,计为A０. 吸取试样溶液０􀆰５０mL,置于１０mL试管中,３７℃平衡５min.加入经３７℃平衡的对硝基苯基ＧαＧDＧ 吡喃半乳糖苷溶液(５􀆰６)０􀆰５０mL,涡旋３s,３７℃保温１０min,加碳酸钠溶液(５􀆰２)４􀆰０mL,以终止酶解反 应,显色５min.以标准空白溶液(８􀆰１)为空白对照,在４００nm波长处测定吸光度,计为A,A－A０为试样 实测吸光值.通过标准曲线计算αＧ半乳糖苷酶的活力. ９　试验数据处理 试样中αＧ半乳糖苷酶活力以X表示,数值以酶活力单位每克(U/g)或酶活力单位每毫升(U/mL)表 示.按公式(１)计算. X＝n m×１０×０􀆰５×f (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: X———试样中αＧ半乳糖苷酶活力的数值,单位为酶活力单位每克(U/g)或酶活力单位每毫升(U/ mL); n———根据试样实测吸光值由标准曲线计算出的对硝基苯酚量的数值,单位为微摩尔(μmol); f———试样的稀释倍数; m———试样质量或体积的数值,单位为克(g)或毫升(mL); １０———反应时间的数值,单位为分钟(min); ０􀆰５———反应加入的酶液体积的数值,单位为毫升(mL). 测定结果以平行测定的算术平均值表示,计算结果保留至整数. １０　精密度 在重复性条件下,２次独立测定结果绝对差值不超过其算术平均值的１０％. ３