2 0 2 3 0 4 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 8 0 1 － － 实 施 饲 料 中 链 霉 素 、 双 氢 链 霉 素 和 卡 那 霉 素 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 3 6 0 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f s t r e p t o m y c i n , d i h y d r o s t r e p t o m y c i n a n d k a n a m y c i n i n f e e d s — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３６０—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:江苏省农业科学院. 本文件主要起草人:魏瑞成、栾枫婷、王冉、龚兰、何涛、朱磊、唐敏敏. ⅠNY/T４３６０—２０２３ 饲料中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的测定 液相色谱Ｇ串联质谱法 １　范围 本文件描述了饲料中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的液相色谱Ｇ串联质谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中链霉素、双氢链霉素和卡那霉 素的测定. 本文件的检出限为０􀆰０５mg/kg,定量限为０􀆰１mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素用混合提取溶液提取,经亲水Ｇ亲脂平衡型固相萃取柱净化, 用液相色谱Ｇ串联质谱仪检测,基质匹配标准溶液校准,外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂.与链霉素、双氢链霉素和卡那霉素溶液接触的容器应使用聚丙烯 材质. ５􀆰１　水:GB/T６６８２,一级. ５􀆰２　甲醇:色谱纯. ５􀆰３　乙腈:色谱纯. ５􀆰４　甲酸:色谱纯. ５􀆰５　乙酸铵:色谱纯. ５􀆰６　异丙醇:色谱纯. ５􀆰７　磷酸二氢钾溶液(０􀆰２mol/L):称取２􀆰７２g磷酸二氢钾,加水溶解并稀释至１００mL,混匀. ５􀆰８　乙二胺四乙酸二钠溶液(０􀆰２mol/L):称取６􀆰７２g乙二胺四乙酸二钠,加水溶解并稀释至１００mL, 混匀. ５􀆰９　２０％三氯乙酸溶液:称取２００g三氯乙酸,加水溶解并稀释至１０００mL,混匀. ５􀆰１０　混合提取溶液:量取５０mL磷酸二氢钾溶液(５􀆰７)、１０mL乙二胺四乙酸二钠溶液(５􀆰８)和５００mL 三氯乙酸溶液(５􀆰９),加水至９００mL,混匀,用氨水调节pH至７􀆰５０±０􀆰２０,用水稀释、定容至１０００mL, 混匀. ５􀆰１１　１０％甲醇溶液:取１０mL甲醇(５􀆰２),加水稀释至１００mL,混匀. ５􀆰１２　乙酸铵溶液(０􀆰１mol/L):称取０􀆰７７g乙酸铵(５􀆰５),加水溶解并稀释至１００mL,混匀. １NY/T４３６０—２０２３ ５􀆰１３　乙酸铵溶液(０􀆰００２mol/L):移取２mL乙酸铵溶液(５􀆰１２),加水稀释至１００mL,混匀. ５􀆰１４　洗脱溶液:取１０mL甲酸(５􀆰４)、５mL异丙醇(５􀆰６)和８５mL乙酸铵溶液(５􀆰１３)混合,用甲酸调节 pH至０􀆰８０±０􀆰１０,混匀. ５􀆰１５　乙酸铵Ｇ甲酸溶液:移取１０mL乙酸铵溶液(５􀆰１２)、５mL甲酸(５􀆰４),用水稀释并定容至５００mL, 混匀. ５􀆰１６　乙酸铵Ｇ甲酸乙腈溶液:移取１０mL乙酸铵溶液(５􀆰１２)、５mL甲酸(５􀆰４),用乙腈(５􀆰３)稀释并定容 至５００mL,混匀. ５􀆰１７　标准储备溶液(１mg/mL):准确称取硫酸链霉素(CAS号:３８１０Ｇ７４Ｇ０,纯度不低于９９％)、硫酸双氢 链霉素(CAS号:５４９０Ｇ２７Ｇ７,纯度不低于９７％)和单硫酸卡那霉素(CAS号:２５３８９Ｇ９４Ｇ０,卡那霉素A纯度 不低于９６％)标准品或对照品各１０mg(以有效成分计,精确至０􀆰０１mg),分别于１０mL聚丙烯容量瓶 中,用水溶解,定容,混匀.储存于聚丙烯瓶中,２℃~８℃保存,有效期１个月. ５􀆰１８　混合标准中间溶液(１０μg/mL):准确移取硫酸链霉素、硫酸双氢链霉素和单硫酸卡那霉素标准储 备溶液(５􀆰１７)１mL于１００mL聚丙烯容量瓶中,用洗脱溶液(５􀆰１４)稀释至刻度,混匀.储存于聚丙烯瓶 中,２℃~８℃保存,有效期１周. ５􀆰１９　混合标准系列工作溶液:准确移取适量体积的混合标准中间溶液(５􀆰１８)于１０mL聚丙烯容量瓶 中,用洗脱溶液(５􀆰１４)稀释配制成浓度分别为１００ng/mL、２００ng/mL、５００ng/mL、１０００ng/mL、２５００ ng/mL、５０００ng/mL混合标准系列工作溶液.临用现配. ５􀆰２０　固相萃取小柱:亲水Ｇ亲脂(HLB)平衡型固相萃取柱,５００mg/６mL. ５􀆰２１　尼龙微孔滤膜:０􀆰２２μm. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱Ｇ串联质谱仪:配有电喷雾离子源. ６􀆰２　分析天平:精度０􀆰１mg和０􀆰０１mg. ６􀆰３　涡旋混合器. ６􀆰４　超声波清洗器. ６􀆰５　离心机:转速不低于１００００r/min. ６􀆰６　固相萃取装置. ６􀆰７　氮吹仪. ６􀆰８　酸度计:精度０􀆰０１. ７　样品 按GB/T２０１９５的规定制备样品,至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm孔径的分析筛,充分混 匀,装入密闭容器中,备用.选取与待测样品类型相同,均匀一致,且在待测物保留时间处仪器响应值小于 方法定量限３０％的饲料样品,作为基质空白样品. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 平行做２份试验.称取２g(精确至０􀆰１mg)试样于５０mL聚丙烯离心管中,准确加入３０mL混合提 取溶液(５􀆰１０),涡旋混合１min,超声提取１５min,其间充分摇动２次,于１００００r/min离心１０min,准确 移取１５mL上清液,用２０％三氯乙酸溶液(５􀆰９)调节pH至６􀆰５０±０􀆰１０,备用. ８􀆰２　净化 依次用５mL甲醇(５􀆰２)和５mL水活化固相萃取小柱(５􀆰２０),将备用液(８􀆰１)全部过柱,用５mL水、 ５mL１０％甲醇溶液(５􀆰１１)分别淋洗,真空负压抽干,准确移取５mL洗脱溶液(５􀆰１４)进行洗脱,收集洗脱 ２NY/T４３６０—２０２３ 液,再次真空负压抽干,涡旋混合１min,过微孔滤膜(５􀆰２１),待测. ８􀆰３　基质匹配标准系列溶液的制备 取基质空白试样,按８􀆰１和８􀆰２处理得到空白基质溶液.准确移取混合标准系列工作溶液(５􀆰１９)各 １００μL分别置于１􀆰５mL聚丙烯进样瓶,用氮气吹干,准确加入１mL空白基质溶液,涡旋混合３０s,配制 成浓度为１０ng/mL、２０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、２５０ng/mL、５００ng/mL的基质匹配标准系列溶 液,待测. ８􀆰４　测定 ８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 色谱柱:酰胺柱,柱长１００mm,内径２􀆰１mm,粒度１􀆰７μm;或者性能相当者. 柱温:３５℃. 流速:０􀆰３mL/min. 进样量:４μL. 流动相:A相为乙酸铵Ｇ甲酸溶液(５􀆰１５);B相为乙酸铵Ｇ甲酸乙腈溶液(５􀆰１６). 梯度洗脱:洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序 时间,min A,％ B,％ ０􀆰０ ２０ ８０ ２􀆰５ ２０ ８０ ３􀆰５ ６５ ３５ ５􀆰５ ９０ １０ ６􀆰７ ９０ １０ ７􀆰５ ２０ ８０ １２􀆰０ ２０ ８０ ８􀆰４􀆰２　质谱参考条件 电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI＋). 检测方式:多反应监测(MRM). 喷雾电压:５􀆰５kV. 雾化温度:５５０℃. 多反应监测(MRM)离子对、去簇电压及碰撞能量见表２. 表２　多反应监测离子对、去簇电压及碰撞能量的参考值 被测物名称 监测离子对,m/z 去簇电压,V 碰撞能量,eV 链霉素５８２􀆰４＞２２１􀆰４ ２７０ ４９ ５８２􀆰４＞２６３􀆰２a２７０ ４４ 双氢链霉素５８４􀆰４＞２４６􀆰２ ２４４ ５７ ５８４􀆰４＞２６３􀆰１a２４４ ４０ 卡那霉素A４８５􀆰２＞３２４􀆰３ ５０ ２４ ４８５􀆰２＞１６３􀆰２a５０ ３３ 　　a　为定量离子. ８􀆰４􀆰３　基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配标准系列溶液(８􀆰３)和试样溶液(８􀆰２)上机测定.基质匹配标 准溶液的定量离子色谱图见附录A. ８􀆰４􀆰４　定性 在相同试验条件下,试样溶液与基质匹配标准系列溶液中待测物的保留时间相对偏差应在±２􀆰５％之 内.根据表２选择的定性离子对,比较试样谱图中待测物定性离子的相对离子丰度与浓度接近的基质匹 ３NY/T４３