2 0 2 3 0 4 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 8 0 1 － － 实 施 植 物 源 性 食 品 中 抗 性 淀 粉 的 测 定 分 光 光 度 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 3 5 8 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f r e s i s t a n t s t a r c h i n f o o d s o f p l a n t o r i g i n b y s p e c t r o p h o t o m e t r y m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３５８—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出. 本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口. 本文件起草单位:北京市营养源研究所有限公司、农业农村部食物与营养发展研究所、内蒙古蒙牛乳 业(集团)股份有限公司、北京东方倍力营养科技有限公司、中国合格评定国家认可委员会、北京工商大学、 北京市农林科学院农产品加工与食品营养研究所、大连工业大学、北京林业大学、安徽燕之坊食品有限公 司、南京西麦大健康科技有限公司、华南理工大学、荃银祥玉(北京)生物科技有限公司、北京植本乐食品科 技有限公司. 本文件主要起草人:崔亚娟、朱大洲、赵笑、孔凡华、杨春雪、白沙沙、刘玉峰、马利军、张慧萍、贺月恩、 蒋峰、蒋彤、李宏、李赫、刘光敏、杜明、杨清、孟冬、安琪、刘井山、李璐、司琳媛、刘锐、张斌、李建华、王姝媛. ⅠNY/T４３５８—２０２３ 植物源性食品中抗性淀粉的测定　分光光度法 １　范围 本文件规定了植物源性食品中抗性淀粉的分光光度测定方法. 本文件适用于植物源性食品中抗性淀粉含量(１g/１００g~７０g/１００g)的测定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 猪胰腺αＧ淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶将试样中非抗性淀粉酶解为葡萄糖,经乙醇洗涤,离心后得 到粗抗性淀粉,氢氧化钾溶液将其溶解,加入淀粉葡萄糖苷酶将粗抗性淀粉酶解为葡萄糖,与葡萄糖 氧化酶Ｇ过氧化物缩合生成红色醌类化合物,在５１０nm处测其吸光度;吸光度值与抗性淀粉含量成 正比. ５　试剂和材料 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　氢氧化钠(NaOH). ５􀆰１􀆰２　氢氧化钾(KOH). ５􀆰１􀆰３　二水合氯化钙(CaCl２􀅰２H２O). ５􀆰１􀆰４　磷酸二氢钾(KH２PO４). ５􀆰１􀆰５　盐酸(HCl). ５􀆰１􀆰６　马来酸(C４H４O４). ５􀆰１􀆰７　４Ｇ氨基安替比林(C１１H１３N３O). ５􀆰１􀆰８　对羟基苯甲酸(C７H６O３). ５􀆰１􀆰９　无水乙醇(CH３CH２OH). ５􀆰１􀆰１０　冰乙酸(CH３COOH). ５􀆰１􀆰１１　猪胰腺αＧ淀粉酶:CAS９０００Ｇ９０Ｇ２,≥５U/mg,２~８℃冰箱储存. ５􀆰１􀆰１２　淀粉葡萄糖苷酶:CAS９０３２Ｇ０８Ｇ０,３２６０U/mL,４℃储存. ５􀆰１􀆰１３　葡萄糖氧化酶:CAS９００１Ｇ３７Ｇ０,２３８U/mg,－２０℃储存. ５􀆰１􀆰１４　过氧化物酶:CAS９００３Ｇ９９Ｇ０,≥３００U/mg,－２０℃储存. ５􀆰２　试剂配制 ５􀆰２􀆰１　４􀆰０mol/L氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠(５􀆰１􀆰１)１６g,缓慢加入６０mL水,溶解后加水稀释至 １NY/T４３５８—２０２３ １００mL,混匀. ５􀆰２􀆰２　２􀆰０mol/L氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠(５􀆰１􀆰１)８g,缓慢加入６０mL水,溶解后加水稀释至 １００mL,混匀. ５􀆰２􀆰３　２􀆰０mol/L氢氧化钾溶液:称取氢氧化钾(５􀆰１􀆰２)１１􀆰２２g,缓慢加入６０mL水,溶解后加水稀释至 １００mL,混匀. ５􀆰２􀆰４　２􀆰０mol/L盐酸溶液:量取盐酸(５􀆰１􀆰５)１８mL,缓慢加入６０mL水中,混合均匀后加水稀释至 １００mL. ５􀆰２􀆰５　１００mmol/L马来酸钠缓冲液:称取马来酸(５􀆰１􀆰６)２３􀆰２g溶于１６００mL水中,用４mol/L氢氧 化钠溶液(５􀆰２􀆰１)调至pH＝６􀆰０,再加入二水合氯化钙(５􀆰１􀆰３)０􀆰６g,加水稀释至２０００mL. ５􀆰２􀆰６　１􀆰２mol/L乙酸钠缓冲液:量取冰乙酸(５􀆰１􀆰１０)７０mL至８００mL水中,用４mol/L氢氧化钠溶 液(５􀆰２􀆰１)调至pH＝３􀆰８,加入稀释定容至１０００mL. ５􀆰２􀆰７　１００mmol/L乙酸钠缓冲液:吸取冰乙酸(５􀆰１􀆰１０)５８０uL至９０mL水中,用４mol/L氢氧化钠溶 液(５􀆰２􀆰１)调至pH＝４􀆰５,加入稀释定容至１００mL. ５􀆰２􀆰８　５０％乙醇溶液:量取无水乙醇(５􀆰１􀆰９)２５０mL,用水稀释并定容至５００mL,混匀. ５􀆰２􀆰９　３００U/mL淀粉葡萄糖苷酶储备液:吸取淀粉葡萄糖苷酶(５􀆰１􀆰１２)２􀆰０mL用马来酸钠缓冲液 (５􀆰２􀆰５)稀释至２２mL,分装于聚丙烯塑料管,放于－２０℃保存. ５􀆰２􀆰１０　混合酶溶液[猪胰腺αＧ淀粉酶(３０U/mL)＋淀粉葡萄糖苷酶(３U/mL)]:称取猪胰腺αＧ淀粉酶 (５􀆰１􀆰１１)１􀆰０g溶于１００mL马来酸钠缓冲液(５􀆰２􀆰５)中,搅拌５min.加入淀粉葡萄糖苷酶１􀆰０mL使用 液(５􀆰２􀆰９),混匀后,３０００r/min离心１０min,取上清液.现用现配. ５􀆰２􀆰１１　GOPODＧ氨基安替比林储备液:称取磷酸二氢钾(５􀆰１􀆰４)１３􀆰６０g、氢氧化钠(５􀆰１􀆰１)４􀆰２g和对羟 基苯甲酸３􀆰０g(５􀆰１􀆰８)至９０mL水中溶解,混匀,用盐酸溶液(５􀆰２􀆰４)或２mol/L氢氧化钠(５􀆰２􀆰２)溶液 调节溶液至pH＝７􀆰４,加水稀释定容至１００mL. ５􀆰２􀆰１２　GOPODＧ氨基安替比林混合液:量取GOPODＧ氨基安替比林储备液(５􀆰２􀆰１１)５０mL,加入 ８００mL水混匀,加入葡萄糖氧化酶(５􀆰１􀆰１３)５０５mg、过氧化物酶(５􀆰１􀆰１４)２􀆰２mg和４Ｇ氨基安替比林 (５􀆰１􀆰７)８１􀆰３mg,混匀,加水稀释定容至１０００mL,－２０℃避光保存. ５􀆰３　标准品 DＧ葡萄糖(C６H１２O６,CAS号:５０Ｇ９９Ｇ７),纯度≥９９􀆰５％(GC)或经国家认证并授予标准物质证书的标 准物质. ５􀆰４　标准溶液配制 DＧ葡萄糖标准工作液(１􀆰０mg/mL):称取DＧ葡萄糖标准品１０􀆰００mg(精确至０􀆰０１mg),用水溶解后 转移至１０mL容量瓶中,定容,现用现配. ６　仪器与设备 ６􀆰１　紫外可见分光光度计. ６􀆰２　分析天平:感量０􀆰０００１g和０􀆰００００１g. ６􀆰３　离心机,转速≥３０００r/min. ６􀆰４　pH计. ６􀆰５　匀浆机. ６􀆰６　涡旋振荡器. ６􀆰７　磨粉机. ６􀆰８　水浴锅:控温范围在３０℃~１００℃,温度波动±１℃. ６􀆰９　恒温水浴摇床:可设定为１００次/min直线运动,控温范围在室温５℃~１００℃,温度波动±１℃. ２NY/T４３５８—２０２３ ７　分析步骤 ７􀆰１　试样制备 固体试样经粉碎、碾磨,过１mm筛(１６目),混匀后备用;其余试样经匀浆机匀浆混匀后备用. ７􀆰２　试样处理 ７􀆰２􀆰１　称样 称取固体试样１００mg(精确至０􀆰０００１g),其余试样称取５００mg(精确至０􀆰０００１g),两份试样质量 差≤５mg. ７􀆰２􀆰２　去除非抗性淀粉 将试样转置离心管(带有螺旋帽)中,加入４􀆰０mL混合酶溶液(５􀆰２􀆰１０),旋紧盖子,振荡器混匀.将 离心管卧式放入恒温水浴摇床,３７℃振荡,孵育１６h.取出,离心管中加入４􀆰０mL无水乙醇(５􀆰１􀆰９),涡 旋振荡１min,３０００r/m离心５min.弃上清液,加入８􀆰０mL乙醇溶液(５􀆰２􀆰８),涡旋振荡混匀, ３０００r/m离心５min.弃上清液,重复上述重悬浮和离心步骤２次,离心管中沉淀物为粗抗性淀粉. ７􀆰２􀆰３　抗性淀粉的水解 离心管中加入２􀆰０mL氢氧化钾溶液(５􀆰２􀆰３),涡旋混匀,冰水浴２０min,期间搅拌４次.迅速向离心 管中加入８􀆰０mL乙酸钠缓冲液(５􀆰２􀆰６),涡旋混匀;加入０􀆰１mL淀粉葡萄糖苷酶(５􀆰１􀆰１２),旋紧盖子,涡 旋混匀.将离心管放置５０℃水浴锅孵育３０min.取出离心管放置室温.对于抗性淀粉含量＜１０％的待 测液于３０００r/m离心５min.对于抗性淀粉含量≥１０％待测液全部转移至１００mL容量瓶,定容,定性 滤纸过滤到５０mL离心管中. ７􀆰２􀆰４　测定 分别吸取０􀆰１０mL试样上清液、DＧ葡萄糖标准工作液和乙酸钠缓冲液(５􀆰２􀆰７)于１０mL玻璃试管中, 加入３􀆰０mLGOPODＧ氨基安替比林混合液(５􀆰２􀆰１２),混匀,５０℃孵育２０min后取出,以乙酸钠缓冲溶液 作为空白溶液进行调零点,在５