2 0 2 3 0 2 1 7 发 布 － － 2 0 2 3 0 6 0 1 － － 实 施 葛 根 中 黄 酮 类 化 合 物 的 测 定 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 3 0 7 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f f l a v o n o i d s i n t h e r o o t o f k u d z u v i n e — H i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y ( H P L C - M S ) Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３０７—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出. 本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口. 本文件起草单位:北京工业大学、浙江省农业科学院、广西壮族自治区农业科学院. 本文件主要起草人:张芳、齐沛沛、王颖、王雨婷、智美丽、裴鹭羽、李宜珊、严华兵、尚小红. ⅠNY/T４３０７—２０２３ 葛根中黄酮类化合物的测定 高效液相色谱Ｇ串联质谱法 １　范围 本文件规定了葛根中黄酮类化合物的高效液相色谱Ｇ串联质谱的定量检测方法. 本文件适用于野葛和粉葛中葛根素、３’Ｇ羟基葛根素、３’Ｇ甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、 染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素和鹰嘴豆芽素A等１１种黄酮类化合物含量的测定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法. ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 葛根样品中的黄酮类化合物用乙醇水溶液超声提取,采用高效液相色谱串联质谱仪测定,外标法 定量. ５　试剂和材料 除非另有规定,所有试剂均为分析纯. ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　水:GB/T６６８２,一级. ５􀆰１􀆰２　甲醇(CH４O):色谱纯. ５􀆰１􀆰３　甲酸(CH２O２):色谱纯. ５􀆰１􀆰４　乙醇(C２H６O):分析纯. ５􀆰２　试剂配制 ５􀆰２􀆰１　１０％甲醇溶液:取１０mL甲醇(５􀆰１􀆰２),加水(５􀆰１􀆰１)定容至１００mL,混匀. ５􀆰２􀆰２　３０％乙醇溶液:取３０mL乙醇(５􀆰１􀆰４),加水(５􀆰１􀆰１)定容至１００mL,混匀. ５􀆰３　标准 黄酮类化合物标准品:相关信息见表１,纯度不低于９８％. ５􀆰４　标准溶液配制 ５􀆰４􀆰１　黄酮类化合物标准储备液:准确称取１１种(表１)待测物质的标准品,用甲醇(５􀆰１􀆰２)溶解后,加入 １０％甲醇溶液(５􀆰２􀆰１)定量稀释,制成高浓度单标准品储备液.分别移取一定量的１１种单标准品储备液 于２５mL容量瓶,１０％甲醇溶液(５􀆰２􀆰１)定容,制成１０mg/L的母液作为标准品储备液.避光－１８℃以 下保存,备用. ５􀆰４􀆰２　黄酮类化合物混合标准溶液:用１０％甲醇溶液(５􀆰２􀆰１)对１０mg/L的母液(５􀆰４􀆰１)稀释配成不同 浓度的混合标准溶液用于绘制标准曲线.混合标准溶液应现用现配. １NY/T４３０７—２０２３ 表１　黄酮类化合物标准品基本信息表 序号 中文名称 英文名称 分子量 CAS号 １ 大豆苷元 Daidzein ２５４􀆰２４ ４８６Ｇ６６Ｇ８ ２ 异甘草素 Isoliquiritin ２５６􀆰２５ ９６１Ｇ２９Ｇ５ ３ 刺芒柄花黄素 Formononetin ２６８􀆰２６ ４８５Ｇ７２Ｇ３ ４ 染料木素 Genistein ２７０􀆰２４ ４４６Ｇ７２Ｇ０ ５ 鹰嘴豆芽素A BiochaninA ２８４􀆰２６ ４９１Ｇ８０Ｇ５ ６ 大豆苷 Daidzin ４１６􀆰３８ ５５２Ｇ６６Ｇ９ ７ 葛根素 Puerarin ４１６􀆰３８ ３６８１Ｇ９９Ｇ０ ８ 刺芒柄花苷 Ononin ４３０􀆰４０ ４８６Ｇ６２Ｇ４ ９ ３’Ｇ羟基葛根素 ３’Ｇhydroxypuerarin ４３２􀆰３８ １１７０６０Ｇ５４Ｇ５ １０ 染料木苷 Genistin ４３２􀆰３８ ５２９Ｇ５９Ｇ９ １１ ３’Ｇ甲氧基葛根素 ３’Ｇmethoxypuerarin ４４６􀆰４０ １１７０４７Ｇ０７Ｇ１ ６　仪器设备 ６􀆰１　超高效液相色谱Ｇ串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI). ６􀆰２　电热鼓风干燥箱:温度５０℃~３３０℃,功率３􀆰１kW. ６􀆰３　超声波清洗器:超声输入功率２００W. ６􀆰４　离心机:转速不低于７５００r/min. ６􀆰５　超细水冷式粉碎机:细度２０目~１８０目(０􀆰８５mm~０􀆰０９mm),功率２􀆰５kW. ６􀆰６　天平:感量０􀆰００１g和０􀆰０００１g. ７　试样制备 ７􀆰１　试样制备 新鲜葛根经清洗去掉泥沙、去皮,用切片机切成２mm薄片后,放置于托盘中,于７０℃烘箱中烘干至 恒重.然后用分级超细水冷式粉碎机将葛根样品粉碎,全部装入洁净的容器中,立即检测.如果需要较长 时间保存,将样品密封、标记后于－１８℃以下保存. ７􀆰２　试样提取 称取葛根粉末０􀆰５g(精确至０􀆰０００１g),置于５０mL离心管中,加入２５mL３０％乙醇溶液(５􀆰２􀆰２), 室温下超声提取４５min.于７５００r/min离心５min,将上清液转移至５０mL容量瓶中.沉淀物再用 ３０％乙醇溶液(５􀆰２􀆰２)洗涤２次,每次用量约５mL.在相同条件下离心５min,合并上清液,３０％乙醇溶 液(５􀆰２􀆰２)定容至５０mL.上样前,采用０􀆰２２μm有机相滤膜过滤(５􀆰５). ８　测定 ８􀆰１　超高效液相色谱参考条件 ８􀆰１􀆰１　色谱柱:ACEExcelC１８柱(１００mm×２􀆰１mm×１􀆰７μm)或性能相当者; ８􀆰１􀆰２　流动相A:甲醇(５􀆰１􀆰２). ８􀆰１􀆰３　流动相B:０􀆰１％甲酸水溶液,取０􀆰１mL甲酸(５􀆰１􀆰３)加水(５􀆰１􀆰１)定容至１００mL,混匀. ８􀆰１􀆰４　柱温:４０℃; ８􀆰１􀆰５　流速:０􀆰３mL/min; ８􀆰１􀆰６　进样量:１０μL; ８􀆰１􀆰７　流动相:梯度洗脱程序见表２. ２NY/T４３０７—２０２３ 表２　梯度洗脱程序 t,min A,％ B,％ ０ ５ ９５ １ ４０ ６０ ３ ８０ ２０ ５ ９５ ５ ７ ９５ ５ ７􀆰１ ５ ９５ ９ ５ ９５ ８􀆰２　质谱参考条件 ８􀆰２􀆰１　扫描方式:正负离子扫描; ８􀆰２􀆰２　离子化电压:４０００V; ８􀆰２􀆰３　毛细管温度:２５０℃; ８􀆰２􀆰４　碰撞气体:氩气(纯度为９９􀆰９９％),压力为２７０kPa; ８􀆰２􀆰５　雾化气:氮气(纯度为９７％以上),流速为３􀆰０L/min; ８􀆰２􀆰６　辅助气:氮气(纯度为９７％以上),流速为１０􀆰０L/min; ８􀆰２􀆰７　检测方式:多反应监测(MRM); ８􀆰２􀆰８　黄酮类化合物保留时间和监测离子对信息见附录A. ８􀆰３　供试样品的测定 在仪器的最佳条件下,分别取黄酮类化合物混合标准溶液(５􀆰４􀆰２)与葛根素等１１种黄酮类化合物样 品(７􀆰２)上机测定.混合标准溶液中１１种黄酮类化合物总离子色谱图和各组分离子色谱图见附录A. ８􀆰４　定性测量 在相同试验条件下测定试样和混合标准溶液,若样品溶液中检出色谱峰的保留时间与基质标准溶液 中目标物色谱峰的保留时间一致(变化范围在±２􀆰５％),且样品溶液的质谱离子对相对丰度与浓度相当基 质标准溶液的质谱离子对相对丰度相比较,相对离子丰度的相对偏差不超过表３规定的范围,则可判定样 品中存在该组分.混合标准溶液中各黄酮类化合物离子色谱图见附录B. 表３　定性时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对丰度(基峰) ５０ ２０~５０ １０~２０ ≤１０ 允许的相对偏差 ±２０ ±２５ ±３０ ±５０ ８􀆰５　定量测量 以不同浓度混合标准溶液的浓度为横坐标,色谱峰面积(响应值)为纵坐标,绘制标准曲线,标准曲线 的相关系数应不低于０􀆰９９.试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内.如 超出线性范围,应重新试验或将试样溶液和基质匹配混合标准系列溶液作相应稀释后重新测定.单点校 准定量时,试样溶液中待测物的浓度与溶剂混合标准溶液的浓度相差不超过３０％.标准加入法则以添加 的标准溶液浓度为横坐标,色谱峰面积(响应值)为纵坐标,绘制标准曲线,并外推至浓度坐标轴. ８􀆰６　结果计算 用液相色谱Ｇ质谱数据处理软件或者按照公式计算试样中检测目标物量,按公式(１)计算. ω＝A×ρs×V×f As×m(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: ω———试样中黄酮类化合物的含量的数值,单位为毫克每千克(mg/kg); A———样品中黄酮类化合物的峰面积; ３NY/T４３０７—２０２３ ρs———标准溶液浓度的数值,单位为毫克每升(mg/L); V———定容体积的数值,单位为毫升(mL); f———稀释倍数; As———