2 0 2 3 0 2 1 7 发 布 － － 2 0 2 3 0 6 0 1 － － 实 施 木 瓜 、 菠 萝 蛋 白 酶 活 性 的 测 定 紫 外 分 光 光 度 法 3 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 0 8 0 . 0 1 C C S B 4 3 0 6 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f a c t i v i t y o f p a p a i n a n d b r o m e l a i n — U l t a r a v i o l e t s p e c t r o p h o t o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３０６—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部农垦局提出. 本文件由农业农村部热带作物及制品标准化技术委员会归口. 本文件起草单位:中国热带农业科学院农产品加工研究所、农业农村部食品质量监督检验测试中心 (湛江)、岭南师范学院. 本文件主要起草人:叶剑芝、韩志萍、潘晓威、李培、曾绍东、齐宁利、苏子鹏、刘元靖、马会芳、周伟、杨 春亮、王标诗. ⅠNY/T４３０６—２０２３ 木瓜、菠萝蛋白酶活性的测定　紫外分光光度法 重要提示:使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验.本文件并未指出所有可能的安全问 题.使用者有责任采取适当的安全和健康措施,并保证符合国家有关法规规定的条件. １　范围 本文件规定了木瓜、菠萝蛋白酶活性测定的紫外分光光度法. 本文件适用于木瓜、菠萝蛋白酶活性的测定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６０１　化学试剂　标准滴定溶液的制备 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 酪蛋白在木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶的催化下,肽键发生断裂,生成的酪氨酸对２７５nm的光具有吸收 作用,吸收强度与蛋白酶的活性成正比,通过分光光度计测量吸光强度,转化为酪氨酸的含量,并据此计算 酶活性. ５　试剂与材料 ５􀆰１　通用要求/试剂纯度等级 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰２　水 GB/T６６８２,一级. ５􀆰３　氢氧化钠溶液(１mol/L) 按GB/T６０１规定的方法配制与标定. ５􀆰４　盐酸溶液(１mol/L) 按GB/T６０１规定的方法配制与标定. ５􀆰５　盐酸溶液(０􀆰１mol/L) 按GB/T６０１规定的方法配制与标定. ５􀆰６　磷酸氢二钠溶液(０􀆰０５mol/L) 称取磷酸氢二钠７􀆰０９８g,精确至０􀆰００１g,加水溶解并定容至１０００mL. ５􀆰７　盐酸半胱氨酸缓冲液(酶稀释液) ５􀆰７􀆰１　称取盐酸半胱氨酸５􀆰２７g,氯化钠２３􀆰４g,精确至０􀆰００１g,加水５００mL溶解. ５􀆰７􀆰２　称取乙二胺四乙酸二钠２􀆰２３g,精确至０􀆰００１g,加水２００mL溶解. ５􀆰７􀆰３　将５􀆰７􀆰１和５􀆰７􀆰２制备的溶液混合,再用１mol/L氢氧化钠溶液(５􀆰３)调节pH至５􀆰０~８􀆰０,移到 １NY/T４３０６—２０２３ １０００mL容量瓶中,加水定容至刻度并混匀. ５􀆰８　酪蛋白溶液(底物溶液) 称取干燥至恒重的酪蛋白(NICPBP国家药品标准物质)０􀆰６g,精确至０􀆰００１g,置于烧杯中,加 ０􀆰０５mol/L磷酸氢二钠溶液(５􀆰６)８０mL,水浴中加热溶解,放冷,用１mol/L盐酸溶液(５􀆰４)调节pH至 ５􀆰０~８􀆰０,移到１００mL容量瓶中,加水至刻度并混匀,现配现用. ５􀆰９　三氯乙酸溶液 称取三氯乙酸１􀆰８g,无水醋酸钠２􀆰９９g,精确至０􀆰００１g,冰醋酸１􀆰９mL,加水溶解并定容至１００mL. ５􀆰１０　酪氨酸标准溶液(５０μg/mL) 称取１０５℃干燥至恒重的酪氨酸０􀆰１０００g,精确至０􀆰０００１g,加入１mol/L的盐酸溶液(５􀆰４)定容 至１００mL,制成１mg/mL的酪氨酸溶液.吸取１mg/mL酪氨酸溶液５􀆰０mL,用０􀆰１mol/L盐酸溶液 (５􀆰５)定容至１００mL,制成５０μg/mL(Cn)的酪氨酸标准溶液. ６　仪器设备 ６􀆰１　紫外分光光度计:波长２００nm~４００nm,并配石英比色皿. ６􀆰２　天平:感量０􀆰００１g和０􀆰０００１g. ６􀆰３　移液器:１mL、５mL、１０mL. ６􀆰４　恒温水浴锅:精度±０􀆰２℃. ６􀆰５　烘箱:精度±５℃. ６􀆰６　pH计:精度０􀆰０１. ６􀆰７　离心机:转速可达４０００r/min,并配备１０mL、１５mL聚丙烯离心管. ６􀆰８　其他常规仪器设备. ７　试样制备与保存 ７􀆰１　木瓜/菠萝蛋白酶溶液(待测酶液) 称取蛋白酶试样约０􀆰１g(W),精确至０􀆰０００１g,置于烧杯中,用约５０mL酶稀释液(５􀆰７)溶解,将酶 液转移至１００mL容量瓶中,加酶稀释液(５􀆰７)至刻度,轻摇使均匀,转入广口瓶中保存待测.酶液配制完 成后应立即检测活性,如不能立即检测,应在４℃保存,时间不应超过２４h.使用前恢复至室温,充分 轻摇. ７􀆰２　阳性对照试样溶液 使用已知活性的木瓜/菠萝蛋白酶试样制备阳性对照试样溶液,按７􀆰１进行配制,配制完成后应立即 检测活性,如不能立即检测,应在４℃保存,时间不应超过２４h.使用前恢复至室温,充分轻摇. ７􀆰３　阴性对照试样溶液 取待测酶液(７􀆰１)１０􀆰０mL于１５mL聚丙烯离心管中,在１００℃±５℃烘箱(６􀆰５)中灭活１５min,冷 却至室温,４０００r/min离心１５min,取上层清液为阴性对照试样溶液,置于１０mL聚丙烯离心管,立即检 测活性,如不能立即检测,应在４℃保存,时间不应超过２４h.使用前恢复至室温,充分轻摇. ８　试验步骤 ８􀆰１　酪氨酸标准溶液测定 以０􀆰１mol/L盐酸溶液(５􀆰５)为空白,于波长２７５nm测定酪氨酸标准溶液(５􀆰１０)吸光度(An). ８􀆰２　试样测定 取待测酶液(７􀆰１)和底物溶液(５􀆰８)各１０mL分别置于不同１５mL聚丙烯离心管中,３７℃±０􀆰５℃恒 温水浴预热５min后,精确量取预热待测酶液１􀆰０mL于１５mL聚丙烯离心管中,加入预热底物溶液 ５􀆰０mL,轻摇混匀,３７℃±０􀆰５℃恒温水浴１０min后,加入三氯乙酸溶液(５􀆰９)５􀆰０mL,振摇,于室温下静 ２NY/T４３０６—２０２３ 置１０min,４０００r/min离心１５min.取上层清液置于１０mL聚丙烯离心管中,２h内于波长２７５nm处测 定其吸光度(A). ８􀆰３　阳性/阴性对照试样测定 取阳性对照试样溶液(７􀆰２)及阴性对照试样溶液(７􀆰３)各１􀆰０mL,按照８􀆰２中的测定方法,检测２个 对照试样的蛋白酶活性,检测结果的相对误差应小于３％. ８􀆰４　试验空白测定 精确量取待测酶液(７􀆰１)１􀆰０mL,置于１５mL聚丙烯离心管中,加入三氯乙酸溶液(５􀆰９)５􀆰０mL, 轻摇,３７℃±０􀆰５℃恒温水浴１０min后,加入底物溶液(５􀆰８)５􀆰０mL,振摇,室温下静置１０min后, ４０００r/min离心１５min.取上层清液置于１０mL聚丙烯离心管中,２h内于波长２７５nm处测定其吸光 度(A０). ９　结果计算 以１g木瓜/菠萝蛋白酶１min水解酪蛋白产生１μg酪氨酸的酶量为１个酶活性单位,用U/g表示. 试样中木瓜/菠萝蛋白酶的活性(X)按公式(１)计算. X＝A－A０ An×Cn W×１０×１１×N (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: X———木瓜/菠萝蛋白酶活性的数值,单位为U/g; A———待测酶液２７５nm波长处吸光度; A０———空白２７５nm波长处吸光度; An———标准溶液２７５nm波长处吸光度; Cn———酪氨酸标准溶液浓度的数值,单位为微克每毫升(μg/mL); W———试样取样量的数值,单位为克(g); １０———反应时间的数值,单位为分(min); １１———测定总体积的数值,单位为毫升(mL); N———蛋白酶的稀释倍数. 试验结果以双份平行测定结果的平均值计,保留整数. １０　精密度 ２次重复测定结果的差值小于算术平均值的３％. １１　试验报告 试验报告应包括如下内容: a)　本报告编号; b)　标识试样所需的细节; c)　试验方法; d)　实验室温度和湿度; e)　所用仪器条件; f)　本文件未规定的任何操作之详情; g)　试验结果; h)　试样数; i)　试验过程任何异常现象; j)　试验日期. ３