2 0 2 3 0 2 1 7 发 布 － － 2 0 2 3 0 6 0 1 － － 实 施 动 物 盖 塔 病 毒 感 染 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 4 3 0 3 — 2 0 2 3 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r a n i m a l g e t a h v i r u s i n f e c t i o n Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３０３—２０２３ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 引言 Ⅲ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　生物安全措施 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　临床诊断 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 　６􀆰１　流行特点 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 　６􀆰２　临床症状 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 　６􀆰３　病理变化 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 　６􀆰４　结果判定 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　样品采集与处理 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 　７􀆰１　样品采集 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 　７􀆰２　样品处理 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　实验室诊断 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 　８􀆰１　病毒分离 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 　８􀆰２　RTＧPCR ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 　８􀆰３　荧光RTＧPCR ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 　８􀆰４　间接ELISA抗体检测 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 　８􀆰５　血清中和试验(噬斑减少中和试验) ６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　综合判定 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　病毒分离相关溶液的配制 ８ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(资料性)　盖塔病毒RTＧPCR、荧光RTＧPCR相关引物和探针 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(规范性)　核酸检测试验用溶液配制 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(规范性)　酶联免疫吸附试验和血清中和试验用溶液的配制 １１ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(资料性)　血清中和试验(噬斑减少中和试验)测定示例 １２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４３０３—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:中国动物卫生与流行病学中心、云南省畜牧兽医科学院. 本文件主要起草人:徐天刚、王静林、左媛媛、李楠、孟锦昕、张慧、何于雯、戈胜强、李阳、王淑娟、吴晓 东、王志亮. ⅡNY/T４３０３—２０２３ 引　　言 盖塔病(GetahVirusDisease)是由披膜病毒科甲病毒属盖塔病毒(GetahVirus,GETV)引起的一种 虫媒性人畜共患病,主要通过蚊、蠓等吸血节肢动物叮咬马、猪等哺乳动物传播.猪作为一种中间宿主,对 盖塔病毒的传播与扩散起到重要作用.该病感染宿主范围较为广泛,可引起人类和许多脊椎动物的无症 状感染,自然条件下已知马和猪感染出现有临床症状,如马的热症、皮疹和水肿,母猪的繁殖障碍和新生仔 猪死亡等.盖塔病主要流行于欧亚大陆和澳大利亚北部的太平洋沿岸地区,近年来我国多有报道并有蔓 延扩散趋势.该病的发生有一定的季节性和地域性,与吸血节肢动物媒介的活跃期和活动范围相关,一旦 传入可呈地方流行或暴发流行.本文件的实施对提高马和猪盖塔病的诊断和监测水平,及时采取防控措 施,保护家畜健康和产业发展,将起到重要作用. 本文件诊断技术内容包括临床诊断、病原学诊断方法和血清学诊断方法.其中推荐的病原核酸RTＧ PCR检测方法与SN/T３１９８—２０１２«猪盖塔病RTＧPCR检测技术规范»相比,具有检测宿主广,引物特异 性好,与经典毒株、流行毒株匹配度更高的优势. 本文件的制定参考了国外相关文献并结合了我国有关研究成果. ⅢNY/T４３０３—２０２３ 动物盖塔病毒感染诊断技术 １　范围 本文件规定了马、猪盖塔病毒感染的临床诊断、样品采集与处理,以及病毒分离、RTＧPCR、荧光RTＧ PCR、间接ELISA抗体检测、血清中和试验等实验室诊断方法的技术要求. 本文件适用于马、猪盖塔病毒感染的诊断、检测、检疫、监测和流行病学调查. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用本文件. GB１９４８９　实验室生物安全通用要求 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. CPE:细胞病变效应(CytopathicEffect) cDNA:互补脱氧核糖核酸(ComplementaryDNA) DEPC:焦碳酸二乙酯(DiethylPyrocarbonate) EDTA:乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid) ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzymelinkedimmunosorbentassay) GETV:盖塔病毒(GetahVirus) MEM:最低限度必需氨基酸营养液(MinimumEssentialMedium) PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline) PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction) PFU:噬斑形成单位(PlaqueFormingUnit) RTＧPCR:反转录Ｇ聚合酶链式反应(ReverseTranscriptＧPolymeraseChainReaction) TAE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ乙酸Ｇ乙二胺四乙酸缓冲液(TrisＧAceticacidＧEDTABuffer) ５　生物安全措施 进行马、猪盖塔病毒感染的诊断、检测时,如动物剖检、样品采集与处理、核酸提取等,按照GB１９４８９ 的规定执行. ６　临床诊断 ６􀆰１　流行特点 ６􀆰１􀆰１　盖塔病毒感染可致马、猪出现明显临床症状. ６􀆰１􀆰２　盖塔病毒可在蚊、蠓等吸血节肢动物媒介体内复制并通过叮咬马、猪等动物进行传播. ６􀆰１􀆰３　盖塔病在马、猪中的暴发时间往往与蚊、蠓等吸血节肢动物媒介的季节高峰期相吻合.每年６ 月—９月通常为该病流行期,气候湿热地区为高流行区域. ６􀆰２　临床症状 １NY/T４３０３—２０２３ ６􀆰２􀆰１　病马临床症状 ６􀆰２􀆰１􀆰１　马主要表现为高烧不退,体温持续３８􀆰５℃~４０℃,一般经历７d~１４d的发病过程后症状消 失,体温恢复正常,通常预后良好. ６􀆰２􀆰１􀆰２　马后肢跗关节水肿和僵硬,颌下淋巴结肿胀和轻度疼痛、精神抑郁、轻度黄疸、阴囊水肿.荨麻 疹偶见,多表现为３mm~５mm大小不等的丘疹,常见于颈肩部、前肢、臀部、股部和小腿部. ６􀆰２􀆰２　病猪临床症状 ６􀆰２􀆰２􀆰１　成年猪表现为轻度发热和厌食. ６􀆰２􀆰２􀆰２　母猪表现为繁殖障碍、产死胎等症状,部分严重者呈犬坐姿势或出现神经症状,最后全身衰竭 死亡. ６􀆰２􀆰２􀆰３　新生仔猪表现为皮肤充血发红、肌肉震颤、精神不振、腹泻、排出棕黄色稀粪,呈现较高的死 亡率. ６􀆰３　病理变化 ６􀆰３􀆰１　马、猪脾脏淋巴细胞和淋巴结可见增