2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 甜 瓜 品 种 真 实 性 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 2 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 1 9 9 — 2 0 2 2 M e l o n ( C u c u m i s m e l o L . ) v a r i e t y g e n u i n e n e s s i d e n t i f i c a t i o n — S S R — b a s e c l m e t h o d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４１９９—２０２２ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　检测方案 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　仪器设备、试剂和溶液配制 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　检测程序 ６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　鉴定意见 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　结果报告 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A　(资料性)溶液配制 １１ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B　(资料性)标记荧光的引物分组信息 １３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C　(资料性)甜瓜品种主要等位变异扩增片段信息 １４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D　(资料性)参照样品及其等位变异信息 １５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４１９９—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC３７)归口. 本文件起草单位:北京市农林科学院蔬菜研究所、全国农业技术推广服务中心、东北农业大学、中国农 业科学院蔬菜花卉研究所、新疆维吾尔自治区农业科学院哈密瓜研究中心、中国农业科学院郑州果树研究 所、北京蔬菜学会. 本文件主要起草人:温常龙、任雪贞、张建、金石桥、许勇、晋芳、杨静静、刘丰泽、王怀松、高鹏、张学军、 赵光伟、张海英、戴祖云. ⅡNY/T４１９９—２０２２ 　 　 　甜瓜品种真实性鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(simplesequencerepeat,SSR)分子标记法进行甜瓜(Cucumismelo L􀆰)品种真实性检测的术语和定义,缩略语,原理,检测方案,仪器设备、试剂和溶液配制,检测程序,鉴定 意见和结果报告. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T３５４３􀆰１　农作物种子检验规程　总则 GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　扦样 GB/T３５４３􀆰５　农作物种子检验规程　真实性和品种纯度鉴定 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 品种真实性验证　varietygenuinenessverification 通过与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实送验样品与其标注的名称是否相符. ３􀆰２ 品种真实性身份鉴定　varietygenuinenessidentification 经SSR分子标记检测并通过已知品种SSR指纹数据比对平台筛查,确定供检样品的真实品种 名称. ３􀆰３ 标准样品　standardsample 国家指定机构保存的具有法定身份的代表品种特征特性的实物样品或DNA样品. ３􀆰４ 参照样品　referencesample 携带SSR位点上主要等位变异的品种,用于辅助确定试验样品的等位变异,校正仪器设备的系统 误差. ３􀆰５ 引物组合　primerpanel 具有不同荧光颜色或相同荧光颜色而扩增片段大小不同、能够组合在一起进行电泳的一组荧光标记 引物. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(basepair) CI:氯仿∶异戊醇(Chloroform:３ＧMethylＧ１Ｇbutanol)(V１∶V２:２４∶１) １NY/T４１９９—２０２２ CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyＧribonucleosidetriphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis) PCI:苯酚∶氯仿∶异戊醇(Phenol:Chloroform:３ＧMethylＧ１Ｇbutanol)(V１∶V２∶V３:２５∶２４∶１) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate) SSR:简单序列重复(simplesequencerepeat) TBE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ硼酸盐Ｇ乙二胺四乙酸二钠(TrisＧBorateＧEDTA) Tris:三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane) １０Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase) ５　原理 甜瓜不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR)的重复次数差异.这种差异 可以从抽取有代表性的试验样品中提取DNA,用SSR引物进行扩增和电泳检测,从而利用扩增片段大小 不同而区分品种. 依据SSR标记检测原理,采用SSR引物,通过与标准样品SSR指纹数据比对或筛查的方式,对品种 真实性进行验证或身份鉴定.品种真实性验证依据SSR位点差异数目而判定,品种真实性身份鉴定依据 被检SSR位点无差异原则进行筛查、鉴定. ６　检测方案 ６􀆰１　总则 对于真实性鉴定,引物、检测平台、样品状况不同,其检测结果的准确度、精确度可能有所不同.应依 据“适于检测目的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,选定适宜的引物、检测平台、样品状况,制订相 应的检测方案. 在严格控制条件下,合成选择的引物,按照确定的检测平台对供检样品按DNA提取、PCR扩增、电 泳、数据分析的程序进行检测. 按规定要求填报检测结果,检测报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息. DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下,按照检 测平台的要求允许对本文件的规定做适宜的调整. ６􀆰２　检测平台 ６􀆰２􀆰１　对于甜瓜品种真实性验证,可选择采用变性PAGE垂直板电泳或者毛细管电泳;对于真实性身份 鉴定,宜采用毛细管电泳.如需要利用SSR指纹数据库,则需要利用参照品种确定试验样品的指纹后再 进行真实性身份鉴定;或在同一电泳板上比较试验样品和标准样品,进行品种真实性验证. ６􀆰２􀆰２　对于供检样品数量较多的,可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增 仪、多引物组合的毛细管电泳进行组合,以提高检测的综合效率. ６􀆰３　引物 ６􀆰３􀆰１　遴选了２３对SSR引物作为甜瓜品种真实性验证和身份鉴定的引物,具体见表１,引物编号为 M０１~M２６,并据此构建了甜瓜品种的SSR指纹数据比对平台. 表１　２６对SSR引物信息 编号 引物名称 染色体退火温度,℃ 引物序列(５′Ｇ３′) M０１ MeSSR０３０ Chr０４ ６０F:GTTGGTGGAATGGTTTGTAAATTGG R:CACTCCCACTGTTTCTTCATCATC ２NY/T４１９９—２０２２ 表１(续) 编号 引物名称 染色体退火温度,℃ 引物序列(５′Ｇ３′) M０２ MeSSR００４ Chr０１ ６０F:TGGCTAACAAACACCCAAACACTC R:ATTA