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2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 - - 2 0 2 3 0 3 0 1 - - 实 施 农 药 登 记 环 境 影 响 试 验 生 物 试 材 培 养 第 7 部 分 : 浮 萍 6 5 . 0 2 0 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 : X X X X - X X X X I C S 1 9 . 0 4 0 C C S B 4 1 9 5 . 7 — 2 0 2 2 G u i d a n c e o n t h e h o u s i n g a n d c a r e o f o r g a n i s m s u s e d f o r e n v i r o n m e n t a l i m p a c t t e s t o f p e s t i c i d e r e g i s t r a t i o n — P a r t 7 : L e m n a S p . N Y / T 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T4195􀆰7—2022 前  言 本文件按照GB/T1􀆰1—2020«标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. NY/T4195«农药登记环境影响试验生物试材培养»分为8个部分: ———第1部分:蜜蜂; ———第2部分:日本鹌鹑; ———第3部分:斑马鱼; ———第4部分:家蚕; ———第5部分:大型溞; ———第6部分:近头状尖胞藻; ———第7部分:浮萍; ———第8部分:赤子爱胜蚓. 本文件是NY/T4195«农药登记环境影响试验生物试材培养»的第7部分. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:农业农村部农药检定所. 本文件主要起草人:周欣欣、陈朗、查金苗、周彬彬、安雪花、韩雪、吕露、张天竞、王菲迪、赵秀振. ⅠNY/T4195􀆰7—2022 农药登记环境影响试验生物试材培养 第7部分:浮萍 1 范围 本文件规定了农药登记环境影响试验用浮萍的引入、验收、培养管理等技术方法,以及记录资料等 要求. 本文件适用于小浮萍(Lemnaminor)、紫背浮萍(Spirodelapolyrrhiza)和圆瘤浮萍(Lemnagibba) 的实验室培养. 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. NY/T3090 化学农药 浮萍生长抑制试验准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. 3􀆰1 保种 preservation 从纯化培养的浮萍中选出一部分浮萍种进行保存,以浮萍种延续为目的,不用于试验. 4 引入与验收 4􀆰1 引入 试验用浮萍应从有资质的供应商或科研机构购买,并具备浮萍品系证明文件.详细描述和记录引入 来源. 4􀆰2 验收 4􀆰2􀆰1 外观确认 检查浮萍状态,包括: ———观察是否存在病变.健康的浮萍叶状体颜色鲜绿、形状基本统一、叶脉清晰;不正常的浮萍可能 出现叶状体萎黄、有凸起或坏疽、浮力缺失等症状; ———观察培养液有无变绿、浑浊等现象出现,是否有藻类、浮游动物及其他杂质存在,以及其他异常 问题. 4􀆰2􀆰2 品系确认 无菌条件下从浮萍中取出少量样本在显微镜下观察,确认浮萍的品系.引入的浮萍要符合NY/T3090 的要求,浮萍形态具体描述见附录A. 5 培养管理 5􀆰1 仪器和设备 所有接触到培养基的容器(三角瓶、表面皿、组织培养瓶等)应为玻璃或其他惰性材料制成,所有玻璃 仪器在使用前应清洗干净,避免化学污染物混入到培养基当中,并在121℃高温湿热灭菌20min.主要仪 器设备如下: 1NY/T4195􀆰7—2022 ———洁净工作台、高压灭菌锅等无菌操作相关设备; ———人工气候箱、光照培养箱、冰箱等培养或保种培养设备; ———生物显微镜、血球计数板或流式细胞仪、紫外分光光度计等观察与计数仪器; ———温度计、照度计(球形传感器/余弦传感器)、pH计等环境监控仪器设备; ———电子天平等称量仪器. ———不锈钢叉、接种杯等操作工具. 5􀆰2 培养基的选择 瑞士标准(SIS)培养基适用于小浮萍和紫背浮萍,20×AAP培养基适用于圆瘤浮萍,Steinberg培养 基适用于小浮萍,Hoagland’sE+培养基适用于浮萍的保种培养.培养基的制备见附录B.培养基配制 用试剂应为分析纯,配制用水应为无菌蒸馏水或去离子水. 5􀆰3 日常培养方法 5􀆰3􀆰1 培养条件 培养区域应具备良好的通风和散热条件.培养期间,保持培养温度(24±2)℃;冷白或暖白荧光灯连 续均匀光照,光照度在6500lx~10000lx范围内[光合有效辐射:85μE/(m2􀅰s)~135μE/(m2􀅰s)]. 培养基pH应符合附录B要求,且变化不超过1􀆰5个单位. 5􀆰3􀆰2 接种传代 5􀆰3􀆰2􀆰1 接种频率:当浮萍铺满容器并发生重叠时,需将浮萍植株转接至新鲜的培养基中.宜每5d~ 7d接种传代1次,接种时宜选用新长出且生长状况良好的浮萍. 5􀆰3􀆰2􀆰2 接种方法:接种前,应提前将培养基、培养器皿等进行高温灭菌.待恢复常温后,用不锈钢叉托 起浮萍,将3簇~4簇浮萍转入盛有培养基的培养器皿中,用橡胶筋扎好灭菌的封口膜或盖上具小孔的玻 璃盖,然后放置于人工气候箱中进行培养,每隔5d~7d更换培养液,以维持培养液中的营养成分浓度的 稳定,接种过程应为无菌操作. 5􀆰3􀆰3 染菌状况检查 培养过程中,应至少每月1次观察培养中的浮萍是否发生污染现象,并记录污染情况.若出现绿藻、 浮游动物等污染情况,需进行分离纯化. 5􀆰3􀆰4 分离纯化 在超净工作台中,用酒精灯灼烧过的接种工具(接种环、不锈钢叉)选取1簇浮萍,将其分成若干单个 体,用酒精灯灼烧过的手术刀片小心地去掉所有浮萍个体的根,放入无菌水中剧烈振荡清洗30s后,将去 根后的浮萍在0􀆰5%(体积分数)的次氯酸钠溶液中浸泡约1min,确保转接的浮萍个体叶状体底部的囊为 绿色,将上述浮萍用无菌水或无菌培养液冲洗干净,转入到新培养基中进行培养. 5􀆰3􀆰5 保种 每1个月~2个月进行1次保种.将浮萍置于(4~10)℃,光照<1000lx条件下进行保种培养.每 周测定培养温度和光照强度.保种培养时间较短时,可选用SIS培养基、20×AAP培养基或Steinberg培 养基;保种培养时间超过1个月时,宜使用营养更为丰富的培养基(如Hoagland’sE+),以防止浮萍出现 萎黄、瘦小等异常症状.在试验前7d~10d,应使用试验用培养基(如SIS培养基)进行培养. 6 记录资料 对于每批次浮萍,实验室应保存完整的培养记录,至少包括以下材料,记录表格见附录C: ———引入与验收记录; ———培养记录; ———环境条件监测记录(温度、湿度、培养基pH等); ———分离纯化记录等. 2NY/T4195􀆰7—2022 附 录 A (资料性) 浮萍形态学描述   A􀆰1 小浮萍(Lemnaminor)的形态学特征 小浮萍见图A􀆰1(左)所示:根1条,白色,3cm~4cm,根冠钝头;叶状体扁平,对称,近圆形或倒卵形, 表面绿色,背面浅黄色或绿白色或紫色,长1􀆰5cm~5cm,宽为2cm~3cm;叶脉3条,不明显;叶状体背 面一侧有囊,新叶状体从囊内浮出. 图A􀆰1 小浮萍(Lemnaminor)、紫背浮萍(Spirodelapolyrhiza)及圆瘤浮萍(Lemnagibba)特征 A􀆰2 紫背浮萍(Spirodelapolyrhiza)的形态学特征 紫背浮萍见图A􀆰1(中)所示:根5(7)~16条;根冠尖呈白绿色;叶状体,扁平,呈圆形或倒卵形,表面 绿色,背面紫色,长5cm~8cm,宽4cm~6cm;掌状脉5条~11条;根基其中一侧具有2个囊,从囊中萌 发新芽. A􀆰3 圆瘤浮萍(Lemnagibba)的形态学特征 圆瘤浮萍见图A􀆰1(右)所示:根1条;叶状体,扁平,呈倒卵形,叶状体顶端非对称性,有明显的气囊, 长3cm~6cm,宽4cm~6cm;叶脉3条~5条;根基其中一侧的囊内形成圆形新芽. 3NY/T4195􀆰7—2022 附 录 B (规范性) 培养基制备   B􀆰1 SIS培养基 SIS培养基的配方见表B􀆰1. 表B􀆰1 瑞士标准(SIS)培养基配方 序号 组分 储备液浓度,g/L 培养基中的含量,mg/L ANaNO3 8􀆰5 85 KH2PO4 1􀆰34 13􀆰4 B MgSO4􀅰7H2O 15 75 C CaCl2􀅰2H2O 7􀆰2 36 D Na2CO3 4􀆰0 20 EH3BO3 1􀆰0 1􀆰0 CuSO4􀅰5H2O 0􀆰0050 0􀆰0050 ZnSO4􀅰7H2O 0􀆰050 0􀆰050 MnCl2􀅰4H2O 0􀆰20 0􀆰20 Na2MoO4􀅰2H2O 0􀆰010 0􀆰010 Co(NO3)2􀅰6H2O 0􀆰010 0􀆰010 FNa2EDTA􀅰2H2O 0􀆰28 1􀆰4 FeCl3􀅰6H2O 0􀆰17 0􀆰84 G MOPS(buffer) 490 490   制备1LSIS培养基:向约900mL无菌蒸馏水或去离子水中分别加入10mL储备液A、5mL储备液B、5mL储备液C、 5mL储备液D、1mL储备液E及5mL储备液F,用0􀆰1mol/L或1mol/LHCl或NaOH调节pH为6􀆰5±0

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