2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 农 药 登 记 环 境 影 响 试 验 生 物 试 材 培 养 第 5 部 分 ： 大 型 溞 1 7 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 C C S B 4 1 9 5 . 5 — 2 0 2 2 G u i d a n c e o n t h e h o u s i n g a n d c a r e o f o r g a n i s m s u s e d f o r e n v i r o n m e n t a l i m p a c t t e s t o f p e s t i c i d e r e g i s t r a t i o n — P a r t 5 : D a p h n i a m a g n a s t a u s . Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４１９５􀆰５—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. NY/T４１９５«农药登记环境影响试验生物试材培养»分为８个部分: ———第１部分:蜜蜂; ———第２部分:日本鹌鹑; ———第３部分:斑马鱼; ———第４部分:家蚕; ———第５部分:大型溞; ———第６部分:近头状尖胞藻; ———第７部分:浮萍; ———第８部分:赤子爱胜蚓. 本文件是NY/T４１９５«农药登记环境影响试验生物试材培养»的第５部分. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:农业农村部农药检定所. 本文件主要起草人:陈朗、周欣欣、袁善奎、逄森、赵榆、安雪花、王娇、陈丽萍、武祥杰、蒋金花、刘伟、蓝 帅、王菲迪. ⅠNY/T４１９５􀆰５—２０２２ 农药登记环境影响试验生物试材培养 第５部分:大型溞 １　范围 本文件规定了农药登记环境影响试验供试大型溞的引入、验收、纯化、保种、驯养、常规培养和常见异 常症状处理等技术方法,以及记录资料要求. 本文件适用于大型溞(DaphniamagnaStraus􀆰)的实验室培养,其他品种的溞类可参照使用,如蚤状 溞(Daphniapulex). ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T５７４９　生活饮用水卫生标准 GB/T３１２７０􀆰１３—２０１４　化学农药环境安全性评价试验准则　第１３部分:溞类急性活动抑制试验 NY/T４１８８　化学农药　大型溞繁殖试验准则 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 休眠卵　dormantegg 冬卵 滞育卵 大型溞进行有性生殖所产受精卵. ３􀆰２ 纯化　purification 通过纯种分离,使所有生物个体均来自一个亲本的培养过程.本文件指纯化后,所获得的大型溞均来 源于同一只雌性溞. ４　引入与验收 ４􀆰１　引入 应从专业的大型溞研究或培养机构引入溞种,并由其提供品系证明. ４􀆰２　验收 新引入的大型溞到达实验室后,在开展相关试验前应进行品系确认.大型溞的生物学背景信息和形 态特征见附录A. 溞种应来自同一个纯化培养群,即为同一只母溞所产的同一批次溞,否则,引入后应在实验室内进行 纯化培养. ５　纯化、保种与驯养 ５􀆰１　纯化 挑选出体大、健康(未表现出任何受胁迫现象,例如体色异常)的幼溞若干只,分别加入盛有培养液的 １NY/T４１９５􀆰５—２０２２ 容器中进行单个培养.选择繁殖量大的母溞,收集其所产的第３胎、第４胎或第５胎幼溞,建立纯化群. ５􀆰２　保种 ５􀆰２􀆰１　从纯化培养的大型溞中选出一部分进行连续的群体培养,以种群延续为目的,不用于试验. ５􀆰２􀆰２　保种培养期间,每３d~４d清理１次幼溞.每２周~３周更新１次保种批次. ５􀆰２􀆰３　保种培养期间,环境条件见６􀆰７部分.可适当降低水温及光照条件要求,但水温不宜超过２５℃. ５􀆰２􀆰４　保种培养的大型溞用于试验前,须先将挑选出的幼溞按照本文件第６部分的规定进行常规培养. ５􀆰３　驯养 常规培养的大型溞用于试验前,应按以下要求进行驯养: ———供试幼溞应为实验室内培养３代以上的非头胎幼溞(＜２４h); ———供试幼溞应来源于同一个健康的母溞种群(未表现出任何受胁迫现象,异常情况见第７部分),且 母溞应在与试验条件(光照、温度、pH、培养液)一致的环境下驯养.用于急性毒性试验时,驯养时间应≥ ４８h;用于繁殖试验时,驯养时间应≥３周.当常规培养过程中使用的培养液与试验用培养液种类不一致 时,应在驯养期间逐步更新培养液.前２周新旧培养液比例由３∶７逐步提高到６∶４,再转换为１００％新 培养液培养１周~２周. ６　常规培养 ６􀆰１　培养设备 ６􀆰１􀆰１　主要仪器设备包括: ———显微镜; ———电子天平等称量仪器; ———培养箱、温度计、pH计、溶解氧测定仪、照度计、硬度计和电导率仪等环境监控仪器设备; ———洁净工作台、高压灭菌锅、TOC测定仪和离心机等饵料培养与制备相关设备. ６􀆰１􀆰２　培养容器 不同来源、不同培养批次的溞应安置在不同编号的容器中单独培养.培养容器应采用玻璃或其他化 学惰性材料制成,无毒、无害、无放射性、耐腐蚀、耐冲击.容器内壁应光滑,且便于观察.尽量避免硅酮 管、硅胶密封圈等材料与培养液接触.容器上方可覆盖保鲜膜(扎孔)或具孔有机玻璃盖等,减少水分蒸 发,避免污染. ６􀆰２　培养液 ６􀆰２􀆰１　宜使用配方明确的重组水,例如ISO标准稀释水、ElendtM４和ElendtM７培养液,配制方法见 GB/T３１２７０􀆰１３附录B.配制重组水的试剂应至少为分析纯等级,配制用水应为蒸馏水或去离子水(电导 率≤１０μS/cm). ６􀆰２􀆰２　除配方明确的重组水外,也可使用自来水等其他水源.自来水应满足GB/T５７４９的要求,其他类 型的培养水源应至少每６个月检测１次水质,满足NY/T４１８８«化学农药　大型溞繁殖试验准则»等相关 试验准则的要求. ６􀆰２􀆰３　每周检测水质.培养液pH应为６~９(以７􀆰８±０􀆰４为宜),硬度为１４０mg/L~２５０mg/L(以 CaCO３计).此外,如使用自来水,还应加测残留氯含量(要求＜１０μg/L);如使用其他类型的培养水源, 应加测电导率(≤５００μS/cm)、总有机碳(TOC,＜２mg/L)等水质指标. ６􀆰２􀆰４　培养液在使用前应曝气处理２４h以上,使溶解氧含量≥３mg/L. ６􀆰３　饵料与饲喂 ６􀆰３􀆰１　使用单种藻或混合藻液作为饵料.藻种宜为近头状尖胞藻(Raphidocelissubcapitata)、普通小球 藻(Chlorellavulgaris)等绿藻. ６􀆰３􀆰２　饲喂前宜对藻液进行浓缩处理.将培养好的新鲜藻液进行离心(以５０００r/min,１０min为宜)处 理,用蒸馏水、去离子水或培养液重新悬浮后继续离心.反复离心３次~４次,用少量培养液重新悬浮后, ２NY/T４１９５􀆰５—２０２２ 冷藏,备用. ６􀆰３􀆰３　推荐每日饲喂１次.饲喂量以投喂后培养液呈淡果绿色(或每只溞０􀆰１mg次/d~０􀆰２mg次/d) 为宜. ６􀆰３􀆰４　每次饲喂时,观察大型溞的生长、繁殖状态,及时清除死亡或不健康的个体以及残渣等.纯化培养 和驯养过程中,喂食前应先移除新生幼溞. ６􀆰４　更换培养液 视需要更换培养液,一般至少每周更换１次.对于保种培养的大型溞,宜每周更换１０％~２０％培 养液. ６􀆰５　更换培养批次 常规培养过程中,应定期更新培养批次.宜收集单个培养容器中的第３胎、第４胎或第５胎幼溞代替 其母溞,作为新的培养批次. ６􀆰６　母溞或幼溞转移 ６􀆰６􀆰１　更换培养批次、更换培养液或收集试验用溞过程中,需对母溞或幼溞进行转移. ６􀆰６􀆰２　转移母溞时,可采用塑料吸管,并剪去吸管尖端,以保证母溞自由通过. ６􀆰６􀆰３　转移幼溞时,对于需丢弃不用的幼溞,可采用筛网分离法.准备两个不同孔径的尼龙筛,上层筛子 孔径约为１mm;下层筛子孔径＜０􀆰５mm.将留在上层筛网中的母溞及时放入培养液中.对于试验用幼 溞,宜用塑料吸管进行转移,并确保吸管顶端的孔径可使幼溞自由通过,以避免产生机械损伤. ６􀆰７　培养条件 ６􀆰７􀆰１　保持良好的培养条件,使大型溞的繁殖保持孤雌生殖状态. ６􀆰７􀆰２　环境条件 培养期间,水温应维持在１８℃~２２℃;光照周期为１６h光照:８h黑暗,光照强度为１０００lx~１５００ lx,或者在室内自然光照条件下培养. ６􀆰７􀆰３　培养密度 常规培养及驯养密度以每容器(如１L~２L烧杯)中１０只~３０只溞为宜.纯化培养过程为单只单容 器培养.保种培养可采用鱼缸等较大型容器,密度不宜超过６０只/L. ７　常见异常症状与处理措施 ７􀆰１　常见异常症状 常见异常症状主要包括: ———出现两性生殖,培养系统中可见休眠卵和/或雄性溞,其形态特征见附录A; ———１０日龄后仍未产溞或每次产溞数量极少; ———生长缓慢、蜕皮不干净; ———游动缓慢、浮于液面; ———体色异常; ———出现大量死胎或死亡幼溞,单日死亡率超过２０％或每天均出现大批量死亡等. ７􀆰２　处理措施 当大型溞培