2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 化 学 农 药 大 型 繁 殖 试 验 准 则 1 7 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 C C S B 4 1 8 8 — 2 0 2 2 C h e m i c a l p e s t i c i d e s — G u i d e l i n e f o r D a p h n i a m a g n a r e p r o d u c t i o n t e s t Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 NY/T４１８８—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:农业农村部农药检定所. 本文件主要起草人:黄健、陈朗、周欣欣、安雪花、赵榆、常艳茹、吕露、王菲迪、杜丽娜、袁善奎、刘琼. ⅠNY/T４１８８—２０２２ 化学农药　大型溞繁殖试验准则 １　范围 本文件规定了化学农药对大型溞繁殖影响试验的材料与条件、主要仪器设备、试验步骤、质量控制、数 据分析和试验报告等的基本要求. 本文件适用于为化学农药登记而进行的大型溞繁殖影响试验,其他类型的农药可参照使用. ２　规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件. ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 亲溞　parentanimals 试验开始时的受试雌溞. ３􀆰２ 冬卵　dormantegg 大型溞进行有性生殖所产受精卵. ３􀆰３ 繁殖量　reproductiveoutput 试验期间亲溞所产的存活幼溞数. ３􀆰４ 无可观察效应浓度　noobservedeffectconcentration,NOEC 在一定暴露期内,与对照组相比,对受试大型溞在统计学意义上(p＜０􀆰０５)未产生显著影响的最高被 试物浓度. 注:单位为毫克有效成分每升(mga􀆰i􀆰/L)或微克有效成分每升(μga􀆰i􀆰/L). ３􀆰５ 最低可观察效应浓度　lowestobservedeffectconcentration,LOEC 在一定暴露期内,与对照组相比,对受试大型溞(繁殖量和死亡率)在统计学意义上(p＜０􀆰０５)产生显 著影响的最低被试物浓度. 注:单位为毫克有效成分每升(mga􀆰i􀆰/L)或微克有效成分每升(μga􀆰i􀆰/L). ３􀆰６ x％效应浓度　x％effectiveconcentration,ECx 在一定暴露期内,引起大型溞繁殖量下降x％的被试物浓度. 注:单位为毫克有效成分每升(mga􀆰i􀆰/L)或微克有效成分每升(μga􀆰i􀆰/L). ４　试验概述 将被试物按等比配制一系列不同浓度的试验溶液,将出生２４h内的非头胎幼雌溞(亲溞)暴露于试验 溶液中开始试验.从亲溞开始繁殖第１批幼溞开始,每天对每只亲溞所产幼溞的存活数和死亡数(包括死 胎数)进行计数与记录.试验周期为２１d.试验结束时,对每只存活亲溞繁殖的存活幼溞总数和每只亲溞 从头胎开始每天所产的存活幼溞数进行统计分析,确定无可观察效应浓度(NOEC)、最低可观察效应浓度 (LOEC)和x％效应浓度(ECx,如可能),评价被试物对大型溞繁殖能力的影响. １NY/T４１８８—２０２２ ５　材料和条件 ５􀆰１　受试生物 ５􀆰１􀆰１　受试生物为大型溞(DaphniamagnaStraus).大型溞保种期间应保持良好的培养条件,使其处 于孤雌生殖状态,避免出现雄溞和冬卵,以及死亡率高(＞５％)、头胎延迟、体色异常等现象. ５􀆰１􀆰２　试验前,大型溞应在试验条件下驯养至少３周.驯养期间,大型溞的培养条件(如光照、温度、培养 液、饲喂量等)应与试验条件相似. ５􀆰１􀆰３　试验开始时,应选用同一个健康母系所产、出生２４h内的非头胎幼雌溞作为受试亲溞. ５􀆰２　被试物 农药原药或制剂.试验前应收集被试物的基本信息,包括但不限于以下数据. a)　结构式; b)　纯度; c)　溶解性; d)　蒸气压; e)　光化学稳定性; f)　试验条件下的稳定性; g)　pKa; h)　正辛醇/水的分配系数(Pow); i)　大型溞急性毒性试验结果等. ５􀆰３　试验容器 试验容器应采用玻璃、不锈钢或其他化学惰性材质,尽量避免硅酮管、硅胶密封圈等与大型溞培养液 及试验溶液接触. ５􀆰４　培养液 ５􀆰４􀆰１　除被试物含有金属离子外,一般情况下宜使用ElendtM４和ElendtM７培养液,配制方法按附录 A执行.如使用其他培养液,其组分中不应含有海藻、土壤提取液等组分不明确的添加物. ５􀆰４􀆰２　培养液中含有组分不明确的添加物(尤其是含有碳组分)时,应在试验报告中详细说明. ５􀆰４􀆰３　添加藻类食物之前应测定培养液/试验液中的总有机碳(TOC)和/或化学需氧量(COD),TOC 应＜２mg/L. ５􀆰５　饲喂 ５􀆰５􀆰１　饲料选择 试验期间应选用浓缩的藻细胞悬浮液作为亲溞食物,如普通小球藻(Chlorellavulgaris)、近头状尖 胞藻(Raphidocelissubcapitata)(原名Pseudokirchneriellasubcapitata,Selenastrumcapricornutum)或 近具刺链带藻(Desmodesmussubspicatus)(原名Scenedesumssubspicatus).可先对藻细胞液进行离心处 理,去除上清液后再加入大型溞培养液以获得浓缩的藻细胞悬浮液. ５􀆰５􀆰２　饲喂量 ５􀆰５􀆰２􀆰１　大型溞饲喂量宜为每天每溞０􀆰１mg有机碳(C)~０􀆰２mgC. ５􀆰５􀆰２􀆰２　藻细胞悬浮液的碳含量可通过替代指标(如藻细胞数或吸光度)进行测量和计算.各实验室应 建立碳含量与替代指标之间的线性图,详见附录B.该线性图应至少每年校准一次,且当藻类的培养条件 发生变化时,应增加校准频率. ５􀆰５􀆰３　饲喂频率 ５􀆰５􀆰３􀆰１　宜每天饲喂.半静态试验中,应至少每周饲喂３次(如更换试验溶液时). ５􀆰５􀆰３􀆰２　尽量使用充分浓缩的藻细胞悬浮液,减少食物添加对暴露浓度的稀释.流水式试验中应详细描 述饲喂量. ２NY/T４１８８—２０２２ ５􀆰６　负载率 ５􀆰６􀆰１　半静态试验中,亲溞应分开培养,即每个容器１只,容器中试验溶液体积为５０mL~１００mL. ５􀆰６􀆰２　可根据被试物浓度分析的需要适当增加试验溶液体积,也可将各重复试验溶液合并后进行分析. ５􀆰６􀆰３　若试验溶液体积超过１００mL,需加大饲喂量,使其满足饲喂量标准. ５􀆰７　光照条件 光照/黑暗时间比为１６h∶８h.水面处光强１５μE/m２/s~２０μE/m２/s(或１０００lx~１５００lx). ５􀆰８　温度条件 试验溶液的温度应控制在１８℃~２２℃.同一个试验中,试验溶液的每日温度变化范围不应超过２℃ (如１９℃~２１℃),试验中宜增加１个试验容器专门用于实际水温的持续监测. ５􀆰９　其他条件 试验开始时和试验期间溶解氧浓度应＞３mg/L.pH应在６~９,且同一个试验中变化范围不应超过 １􀆰５个单位.硬度应＞１４０mg/L(以CaCO３计).试验期间不应进行曝气处理. ６　主要仪器设备 ６􀆰１　电子天平(感量０􀆰０００１g以上). ６􀆰２　显微镜. ６􀆰３　pH计. ６􀆰４　溶解氧测定仪. ６􀆰５　照度计. ６􀆰６　硬度计. ６􀆰７　分析仪器. ６􀆰８　TOC测定仪或COD测定仪. ６􀆰９　环境条件控制和监测的相关设施与设备等. ７　试验步骤 ７􀆰１　试验方法的选择 根据被试物的特性选择半静态法或流水式法进行试验.采用半静态法时,试验溶液中被试物的浓度 应保持在设定浓度或初始测定浓度的±２０％.对于难处理农药(难溶或略溶于水、易挥发、易降解、易被吸 附、疏水性、离子型或多组分农药等),参考NY/T３２７３选择试验方法. ７􀆰２　预试验 参考被试物及其类似化合物对溞类或其他水生生物的毒性等资料,视需要开展预试验.预试验按正 式试验条件,以较大间距设置若干组浓度.试验周期为２１d,当根据阶段性试验结果能够预估出毒性效应 水平时,可提前结束预试验. ７􀆰３　正式试验 正式试验应至少设置５个处理组和１个空白对照组.处理组浓度按几何级数排列,公比≤３􀆰２.对于 难溶于水的被试物,可用少量对大型溞无毒的有机溶剂(如丙酮、N,NＧ二甲基甲酰胺等)、乳化剂或分散 剂助溶,但助溶剂/助分散剂的用量应尽可能小(≤１００mg/L或≤０􀆰１mL/L),且在各处理组和对照组中 的用量一般应尽可能保持一致.此外,还应增设助溶剂/助分散剂对照组. ７􀆰３􀆰２　对于半静态试验,每一处理组和对照组应至少１０只溞,单只培养.对于流水式试验,每一处理组 和对照组至少２０只溞(以４０只为宜),分配到至少４个重复中. ７􀆰３􀆰３　试验开始时,应将亲溞随机分配至各试验容器中. ７􀆰３􀆰４　试验周期为２１d. ７􀆰４　限度试验 ３NY/T４１８８—２０２２ ７􀆰４􀆰１　限度试验浓度为１０mga􀆰i􀆰/L或最大溶解度浓度(二者取较低值). ７􀆰４􀆰２　限度试验中,处理组与对照组的各项观测指标应在统计学意义上无显著差异(p＜０􀆰０５). ７􀆰５　染毒 ７􀆰５􀆰１　用培养液将被试物配制成一系列不同浓度的试验溶液,加入试验容器中. ７􀆰５􀆰２　向试验