2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 大 白 菜 品 种 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 2 4 7 6 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f h e a d i n g C h i n e s e c a b b a g e v a r i e t i e s — S S R m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 N Y / T 2 4 7 6 — 2 0 1 3NY/T２４７６—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　主要仪器设备及试剂 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　溶液配制 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　引物信息及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　参照品种及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果判定与表述 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　主要仪器设备及试剂 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(规范性)　溶液配制 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(规范性)　引物及序列 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　引物相关信息 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(资料性)　参照品种相关信息 １４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录F(资料性)　引物分组 １５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T２４７６—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替NY/T２４７６—２０１３«大白菜品种鉴定技术规程SSR分子标记法»,与NY/T２４７６—２０１３ 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　增加了CRIB１Ｇ４３(A１连锁群)、CRIB１Ｇ５４(A１连锁群)、CRIB２Ｇ２３(A２连锁群)、CRIB３Ｇ２２(A３连 锁群)、CRIB３Ｇ２８(A３连锁群)、CRIB４Ｇ１０(A４连锁群)、CRIB５Ｇ１１(A５连锁群)、CRIB６Ｇ３(A６连 锁群)、CRIB６Ｇ２３(A６连锁群)、CRIB７Ｇ１９(A７连锁群)、CRIB８Ｇ１２(A８连锁群)、CRI１０Ｇ３０(A１０ 连锁群)、CRI１０Ｇ４０(A１０连锁群)等１３对引物及相应的等位变异和参照品种; b)　删除了cnu_m１３９a(A１连锁群)、nia_m０８６a(A１连锁群)、nia_m０９８a(A１连锁群)、cnu_m０７３a (A３连锁群)、cnu_m２８８a(A３连锁群)、cnu_m３２７a(A３连锁群)、nia_m１０１a(A３连锁群)、nia_ m０４９a(A６连锁群)、cnu_m０５０a(A６连锁群)、cnu_m１４９a(A６连锁群)、cnu_m０１６a(A９连锁 群)、nia_m０３８a(A６连锁群)、nia_m０３５a(A１０连锁群)等１３对引物及相应的等位变异和参照品 种. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:山东省农业科学院作物研究所、农业农村部科技发展中心. 本文件主要起草人:李汝玉、郑永胜、张晗、王丽媛、王穆穆、马莹雪、王晖、王东建、段丽丽、李华、安聪 聪、耿慧晶、程惠敏、冯艳芳、王玮. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２０１３年首次发布为NY/T２４７６—２０１３; ———本次为第一次修订. ⅡNY/T２４７６—２０２５ 大白菜品种鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(SSR)标记进行大白菜[BrassicarapaL􀆰ssp􀆰Pekinensis(Lour􀆰) Olsson]品种鉴定的术语和定义、缩略语、原理、主要仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息及使用、参照品 种及使用、操作程序、结果判定与表述. 本文件适用于大白菜品种DNA分子数据采集和品种鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　扦样 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T２５９４　植物品种鉴定　DNA分子标记法　总则 ３　术语和定义 NY/T２５９４界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. APS:过硫酸铵(ammoniumpersulphate). bp:碱基对(basepair). CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide). DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid). dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyＧribonucleosidetriphosphates). EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid). PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis). PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction). SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat). Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase). TBE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ硼酸盐Ｇ乙二胺四乙酸(TrisＧborateＧEDTA). TE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ乙二胺四乙酸(TrisＧEDTA). TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N′,N′Ｇtetramethylethylenediamine). Tris:三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM). ５　原理 大白菜品种基因组中存在着大量能够稳定遗传的SSR标记,不同大白菜品种在同一SSR的重复次 数存在差异,这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测,进而区分不同的品种. ６　主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂见附录A. １NY/T２４７６—２０２５ ７　溶液配制 溶液配制方法见附录B. ８　引物信息及使用 引物及序列见附录C,引物相关信息见附录D.利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测时选择普 通引物;利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物,荧光标记位于正向引物５′端,推荐的荧光标记见 附录D.可利用附录C中的引物序贯检测,当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品不同时,停 止检测. ９　参照品种及使用 参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异,宜与送检样品同时检测,参照品种相关信息 见附录E. １０　操作程序 １０􀆰１　样品准备 送检样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官.种子样品需扦样时,应符合GB/T３５４３􀆰２的规定.每 份样品不少于３０个个体,等量混合分析,必要时进行个体检测. １０􀆰２　DNA提取 取幼嫩组织混合样０􀆰２g,放入１􀆰５mL离心管中,经液氮冷冻后充分研磨.或将３０粒种子研碎,放 入１􀆰５mL离心管中.每管加入４００μL预热到６５℃的CTAB提取液,充分混合;６５℃水浴４５min~ ６０min,每隔１５min轻缓颠倒混匀１次.每管加入４００μL２４∶１氯仿Ｇ异戊醇(V/V),振荡混匀. １００００g离心１０min.吸取上清液２００μL转入新的１􀆰５mL离心管中,加入４００μL－２０℃预冷无水乙 醇沉淀DNA.１２０００r/min离心１min,