2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 高 粱 品 种 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 2 4 6 7 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f s o r g h u m v a r i e t i e s — S S R m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 N Y / T 2 4 6 7 — 2 0 1 3NY/T２４６７—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　主要仪器设备及试剂 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　溶液配制 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　引物信息及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　参照品种及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果判定与表述 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　主要仪器设备及试剂 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(规范性)　溶液配制 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(规范性)　引物及序列 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　引物相关信息 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(资料性)　参照品种相关信息 １５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录F(资料性)　引物分组 １６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T２４６７—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替NY/T２４６７—２０１３«高粱品种鉴定技术规程　SSR分子标记法»,与NY/T２４６７—２０１３ 相比,除结构调整和编辑性修改外,主要技术变化如下: a)　增加了“NY/T２５９４　植物品种鉴定　DNA指纹方法　总则”(见第２章)、“缩略语”(见第４ 章)、“参照品种及使用”(见第９章)、“参照品种相关信息”(见附录E); b)　删除了“品种”“核心引物”“参照品种”(见第３章); c)　修改了“反应体系”(见１０􀆰３􀆰１)、“反应程序”(见１０􀆰３􀆰２)、“引物及序列”(见附录C)、“引物相关 信息”(见附录D). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:吉林省农业科学院(中国农业科技东北创新中心). 本文件主要起草人:李晓辉、张春宵、吴律、辛贵民、李淑芳、王吉艳、周紫阳、郝彩环、刘学岩、董菁、李 继洪、王鼐、陈冰嬬. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２０１３年首次发布为NY/T２４６７—２０１３; ———本次为第一次修订. ⅡNY/T２４６７—２０２５ 高粱品种鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(SSR)标记进行高粱(SorghumbicolorL􀆰)品种鉴定的术语和定义、 缩略语、原理、主要仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息及使用、参照品种及使用、操作程序、数据记录、结 果判定与表述. 本文件适用于高粱品种DNA分子数据采集和品种鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　扦样 GB４４０４􀆰１　粮食作物种子　禾谷类 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T１９５５７􀆰１５　植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南　高粱 NY/T２５９４　植物品种鉴定DNA分子标记法　总则 ３　术语和定义 NY/T２５９４界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. APS:过硫酸铵(ammoniumpersulphate). bp:碱基对(basepair). CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide). DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid). dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate). EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid). PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis). PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction). SBI:高粱染色体符号[Sorghumbicolor(L􀆰)chromosomesideogram]. SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat). Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase). TE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ乙二胺四乙酸(TrisＧEDTA). TBE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ硼酸盐Ｇ乙二胺四乙酸(TrisＧborateＧEDTA). TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N′,N′Ｇtetramethylethylenediamine). Tris:三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM]. ５　原理 高粱品种基因组存在着大量能够稳定遗传的SSR标记,不同高粱品种在同一SSR的重复次数存在 差异,这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测,进而区分不同的高粱品种. １NY/T２４６７—２０２５ ６　主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂见附录A. ７　溶液配制 溶液配制方法见附录B. ８　引物信息及使用 引物及序列见附录C,引物相关信息见附录D.利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测时选择普 通引物;利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物,荧光标记位于正向引物５′端,推荐的荧光标记见 附录D.可利用附录C中的引物序贯检测,当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品不同时,停 止检测. ９　参照品种及使用 参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异,宜与送检样品同时检测,参照品种相关信息 见附录D和附录E. １０　操作程序 １０􀆰１　样品准备 送检样品材料可为种子、幼嫩叶片等组织或器官.送检样品为种子时,应符合GB４４０１􀆰１中对高粱 种子纯度的要求. 种子样品需扦样时,应符合GB/T３５４３􀆰２的要求.每份样品不少于２０个个体,等量混合分析,必要 时进行个体检测. １０􀆰２　DNA提取 称取样品约２００mg,置于２􀆰０mL圆底离心管中,经液氮冷冻后充分研磨.每管加入７００μL预热到 ６５℃的CTAB缓冲液,并使其混匀.６５℃水浴加热４５min,每隔１５min轻缓颠倒混匀.水浴后,取出离 心管,冷却至室温.每管加入７００μL的三氯甲烷和异戊醇的混合液(体积比为２４∶１),轻缓混匀５min~ １０min.１２０００r/min离心１０min,将上清液转至新２􀆰０mL离心管中.每管加入１０μLRNA酶溶液 (１０mg/mL),３７℃下水浴３０min.加入７００μL的三氯甲烷和异戊醇的混合液(体积比为２４∶１),轻缓 混匀５min~１０min.１２０００r/min离心１０min,将上清液转至新２􀆰０mL离心管中.加入Ｇ２０℃预冷的 异丙醇(１倍体积)或无水乙醇(２倍体积),轻轻混匀.－２０℃静置至DNA凝集,室温下钩出DNA.用体 积分数为７０％乙醇溶液洗涤２次,晾干.加入２００mL的１×TE缓冲液充分溶解,检测DNA浓度和质 量,－２０℃下保存备用. 注１:以上为推荐的DNA提取方法,D