ICS 67.050 CCS X 04 GH 中 华 人 民 共 和 国 供销合作行 业 标 准 GH/T 1475—2024 食用菌中游离麦角甾醇的测定 高效液相色谱法 Determination of free ergosterol in edible fungi —High performance liquid chromatography 2024 - 12 - 17发布 2025 - 06 - 01实施 中华全国供销合作总社 发布 GH/T 1475 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华全国供销合作总社提出并归口。 本文件起草单位： 中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所、安徽金寨仙芝灵生物科技有限公司、 玉溪市质量技术监督综合检测中心 、西南林业大学、云南省药物研究所、云南省医疗器械检验研究院、 云南省食用菌产业发展研究院、云南云菌科技（集团）有限公司、 浙江工业大学 、云南省供销合作社联 合社、赛默飞世尔科技（中国）有限公司 。 本文件主要起草人： 孙达锋、华蓉、游金坤、曹燕妮、 黄守文、 王娟、陈贺、董娇、谭莹、崔佳丽、 侯英、魏建强、聂蕾、聂姣、陈水廷、代秋琼、邓雅元、 赵春艳、 杨璐敏、 刘寅山、 邵平、方媛、何俊、 李江、熊新辉。 GH/T 1475 —2024 1 食用菌中游离麦角甾醇的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件建立了食用菌中游离麦角甾醇含量的高效液相色谱测定方法。 本文件适用于 食用菌中游离麦角甾醇含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 鲜样 fresh sample 采收后未经加工，保留其自然特性的食用菌样品。 干样 dry sample 经过自然干燥或人工干燥方法加工的食用菌样品。 4 原理 试样中游离麦角甾醇 经甲醇超声提取 以及C18色谱柱分离后， 用配有紫外检测器的 高效液相色谱仪测 定，外标法定量。 5 试剂与材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯 。 水为 GB/T 6682规定的一级水 。 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 甲醇（CH3OH）。 麦角甾醇标准品（ C28H44O，CAS：57-87-4）：纯度 ≥ 96%，不确定度 2.0%，经国家认证并授予标准 物质或标准样品证书。 麦角甾醇标准储 备液 （500 μg/mL）:准确称取 5.00 mg麦角甾醇标准品 （ 5.4） （精确至 0.01 mg）, 用甲醇(5.2)超声溶解并定容至 10 mL，摇匀。置于 4 ℃冰箱中，有效期 30天。 麦角甾醇使用液（ 100 μg/mL ）：准确移取 2.00 mL麦角甾醇标准储备液（ 5.5），用甲醇 (5.2) 稀释并定容至 10 mL，摇匀。现配 现用。 微孔滤膜： 0.45 µm，有机系。 6 仪器与设备 高效液相色谱仪，配有紫外检测器。 GH/T 1475 —2024 2 分析天平 ：感量0.1 mg和0.01 mg。 粉碎机。 离心机：转速≥ 5 000 r/min。 超声波清洗器（功率大于 720 W；频率大于 40 kHz）。 匀浆机。 涡旋振荡器。 标准筛： 0.425 mm。 7 试样制备 鲜样制备 取500 g食用菌鲜样 ，清除表面附着物 ，切碎后放入匀浆机（ 6.6）将样品 匀浆，立即测定或者 -18 ℃ 冷冻保存。 称取试样时，冷冻试样应先解冻再混匀。 干样制备 取200 g食用菌干样，用粉碎机（ 6.3）粉碎，过0.425 mm 标准筛(6.8)，立即测定 或者密封容器中 室温保存备用。 8 试验步骤 试样提取 8.1.1 鲜样 称取1 g（精确至 0.1 mg）的试样，置于50 mL离心管中，加入甲醇（ 5.3）40 mL，涡旋混匀，超 声提取30 min后，冷却至室温， 5 000 r/min 离心5 min，取上清液过 0.45 µm微孔滤膜（ 5.7）作为 待测液。 8.1.2 干样 称取0.2 g（精确至 0.1 mg）的试样，置于50 mL离心管中，加入甲醇（ 5.3）20 mL，涡旋混匀， 超声提取 60 min后，冷却至室温， 5 000 r/min 离心5 min，取上清液过 0.45 µm微孔滤膜（ 5.7）作 为待测液。 液相色谱参考条件 a) 色谱柱：C18柱，柱长 250 mm，内径4.6 mm，粒径5 µm，或相当性能的色谱柱 ； b) 流动相：甲醇（ 5.2）； c) 流速：1.0 mL/min ； d) 检测波长： 282 nm； e) 进样量： 10 μL； f) 柱温：40 ℃。 标准曲线制作 分别准确吸取麦角甾醇使用液（ 5.6）0.05 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL， 用甲醇(5.2)稀释并定容至 5 mL，标准系列工作液浓度分别为 1.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.0 μg/mL 、 20.0 μg/mL 、50.0 μg/mL、100 μg/mL。将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，按液相色谱 参考条件测定，以麦角甾醇质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。标准品色谱图 见附录A.1。 测定 GH/T 1475 —2024 3 将待测液注入高效液相色谱 仪（6.1）中，按照保留时间进行定性，外标法定量。待测液中游离麦 角甾醇的质量浓度应在标准曲线范围内，超过线性范 围应稀释后再进行分析。 典型样品色谱图见附录 A.2-A.5。 空白试验 不加试样，按同一操作方法做空白试验。 9 计算结果 试样中游离麦角甾醇含量按下式计算： 𝜔=(𝑐−𝑐0)×𝑉×𝑓 𝑚×10−3 式中： ω ——试样中游离麦角甾醇含量，单位为克每千克 (g/kg)； c ——标准曲线计算得到的试样液中麦角甾醇的浓度 (μg/mL) ； c0 ——标准曲线计算得到的 空白液中麦角甾醇的浓度 (μg/mL) ； V ——提取时准确加入的甲醇体积 (mL)； m ——试样的质量（ g）； f ——试样液稀释倍数 ； 10-3 ——将结果单位由 μg/g换算为g/kg的换算系数； 计算结果 以重复性条件下获得的 两次独立测定结果的算术平均值表示，结果 保留三位有效数字 。 10 精密度 在重复性条件下，获得的两 次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值的 10%。 11 其他 当干样称样量为 0.2 g， 加入甲醇提取液体积为 20 mL时， 方法检出限为 0.01 g/kg ，定量限为 0.03 g/kg； 当鲜样称样量为 1.0 g， 加入甲醇提取液体积为 40 mL时， 方法检出限为 0.005 g/kg ， 定量限为 0.015 g/kg。 GH/T 1475 —2024 4 A A 附录 A （资料性附录） 麦角甾醇标准品及常见食用菌中游离麦角甾醇色谱图 A.1 麦角甾醇标准溶液色谱图 ，见图A.1。 图A.1 20 μg/mL麦角甾醇标准溶液色谱图 A.2 香菇（鲜品） 游离麦角甾醇色谱图， 见图A.2。 图A.2 香菇（鲜品）游离麦角甾醇色谱图 A.3 金针菇（鲜品）游离麦角甾醇色谱图 ，见图A.3。