ICS 67.180.10 CCS X31 中 华 人 民 共 和 国 供 销 合 作 行 业 标 准 GH/T 1452—2024 GH 蜂蜜中葫芦巴碱含量的测定 液相色谱 -串 联质谱法 Determination of trigonelline in honey — liquid chromatography -tandem mass spectrometry method 2024-03 - 22发布 2024 - 09 - 01实施 中华全国供销合作总社 发布 GH/T 1452 —2024 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华全国供销合作总社提出。 本文件由全国蜂产品标准化 技术委员会（SAC/TC601）归口。 本文件起草单位： 秦皇岛海关技术中心、 上海冠生园蜂制品有限公司、 江苏蜂奥生物科技有限公司、 喀什海关技术中心、 厦门喜多多食品销售有限公司、 西双版纳金棕生物科技有限公司 、福建省产品质量 检验研究院、 中国蜂产品协会、 武汉安孕堂食品技术开发有限公司。 本文件主要起草人： 崔宗岩、温昊松、 张孙现、张琴、黄学者、 贾英杰、张羽、 孙国峰、 李文丽、 祖铁红、 管志斌、 许永生、李娜 、贾光群、 刘晓茂、 张进杰。 GH/T 1452 —2024 2 蜂蜜中葫芦巴碱含量的测定 液相色谱 -串联质谱法 1 范围 本文件规定了蜂蜜中葫芦巴碱含量的液相色谱 -串联质谱测定方法 。 本文件适用于蜂蜜中葫芦巴碱含量的测定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样用0.1%甲酸溶液溶解，其中葫芦巴碱经阳离子固相萃取柱提取净化，液相色谱 -串联质谱仪测 定，内标法 定量。 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 甲酸（ CH 2O2）：色谱纯。 5.1.2 甲醇（ CH 3OH）：色谱纯。 5.1.3 氨水（ NH 3·H2O）。 5.1.4 乙腈（CH 3CN）：色谱纯。 5.1.5 乙酸铵（ CH 3COONH 4）：色谱纯。 5.2 溶液配制 5.2.1 0.1%甲酸溶液：取 1 mL甲酸（ 5.1.1）于 1000 mL 容量瓶中， 用水定容至刻度，混匀。 5.2.2 2%氨水甲醇溶液：取 2 mL氨水（ 5.1.3）于100 mL容量瓶中 ，用甲醇（ 5.1.2）定容至刻度，混 匀。 5.2.3 80%甲醇水溶液：取 80 mL甲醇（ 5.1.2）于100 mL容量瓶中 ，用水定容至刻度，混匀。 5.2.4 5 mmol/L乙酸铵溶液 ：称取 0.385 g乙酸铵（ 5.1.5）于1000 mL 容量瓶中， 用水溶解并 定容至刻 度，混匀。 5.3 标准品 GH/T 1452 —2024 3 5.3.1 葫芦巴碱（ Trigonelline ，C7H7NO 2，CAS号：535-83-1，纯度 ≥99%）。 5.3.2 葫芦巴碱 -d3（Trigonelline -d3，C7H4D3NO 2，纯度 ≥98%）。 5.4 标准溶液配制 5.4.1 葫芦巴碱标准储备液（ 1 mg/mL）：准确称取葫芦巴碱（ 5.3.1）标准品 10 mg（精确至 0.01 mg）， 置于 10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解、稀释并定容，混匀，配制成浓度 为1 mg/mL 的葫芦巴碱 标准储 备液，2~8 ℃条件下保存 ，有效期 6个月。 5.4.2 葫芦巴碱 -d3储备液 （ 1 mg/mL） ： 准确称取葫芦巴碱 -d3（5.3.2） 标准品 10 mg（精确至 0.01 mg）， 置于 10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解、稀释并定容，混匀，配制成浓度 为1 mg/mL的葫芦巴碱 -d3储备 液， 2~8 ℃条件下保存 。 5.4.3 葫芦巴碱标准中间溶液： 准确移取葫芦巴碱标准储备液（ 5.4.1）100 μL，于 10 mL容量瓶中，用 80%甲醇水溶液 （5.2.3）稀释并定容 ，混匀后配制成浓度为 10 μg/mL的葫芦巴碱 标准中间溶液， 2~8 ℃ 条件下保存，有效期 3个月。 5.4.4 葫芦巴碱 -d3中间溶液： 准确移取葫芦巴碱 -d3标准储备液（ 5.4.2）100 μL，于 10 mL容量瓶中， 用80%甲醇水溶液 （5.2.3）稀释并定容， 混匀后配制成浓度为 10 μg/mL 的葫芦巴碱 -d3中间溶液， 2~8 ℃ 条件下保存。 5.4.5 葫芦巴碱标准工作溶液： 分别移取 葫芦巴碱标准中间溶液 （ 5.4.3）10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、 200 μL、500 μL至10 mL容量瓶中， 并分别加入 100 μL葫芦巴碱 -d3中间溶液（ 5.4.4），用 80%甲醇水 溶液（5.2.3）稀释至刻度， 分别配制成浓度为 0.01 μg/mL 、0.02 μg/mL 、0.05 μg/mL 、0.1 μg/mL 、0.2 μg/mL 、 0.5 μg/mL 的葫芦巴碱 标准工作溶液（ 葫芦巴碱 -d3浓度均为0.1 μg/mL ），用于绘制标准工作曲线。标 准工作溶液现用现配。 5.5 材料 5.5.1 强阳离子固相萃取柱： 60 mg/3 mL ，或相当者。 5.5.2 微孔滤膜：有机系，规格 0.22 µ m。 6 仪器和设备 6.1 液相色谱 -串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 6.2 分析天平 ：感量 0.01 g和0.00001 g 。 6.3 涡旋混合器。 6.4 固相萃取装置。 6.5 氮吹仪。 6.6 容量瓶： 10 mL、50 mL、100 mL、1000 mL。 7 试样制备与保存 7.1 试样的制备 对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过 60 ℃的水浴 中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出 200 g作为试样。制备好的试样置于样品瓶 中，密封，并做上标记。 7.2 试样的保存 试样于常温下保存。 8 测定步骤 GH/T 1452 —2024 4 8.1 提取 称取蜂蜜样品 2 g（精确至 0.01 g）至烧杯中，加入 适量 0.1%甲酸溶液溶解并转移至 50 mL容量瓶 中，用0.1%甲酸溶液冲洗烧杯 两次并转移至容量瓶中，定容，混匀。 含量超出线性范围的样品 需适当 倍数稀释。 然后取 1.0 mL溶液于样品瓶中 ，向其中加入 10 μL葫芦巴碱 -d3中间溶液 （5.4.4），混匀后 待固相萃取净 化。 8.2 净化 强阳离子固相萃取柱（ 5.5.1）依次用 3 mL甲醇活化和 3 mL水平衡，上述加入内标的提取液上样 至固相萃取柱，依次用 3 mL水和 3 mL甲醇淋洗， 抽干，用 3 mL 2%氨水甲醇溶液（ 5.2.2）洗脱。收 集洗脱液， 50 ℃条件下氮气吹干。加入 80%甲醇水溶液（ 5.2.3）1 mL，涡旋 1 min溶解残余物，微孔 滤膜（5.5.2）过滤，液相色谱 -串联质谱仪测定。 8.3 测定 8.3.1 液相色谱参考条件 a) 色谱柱： HILIC柱（ 2.1 mm×100 mm，1.7 µ m），或相当者； b) 流动相： A相为乙腈 （5.1.4），B相为 5 mmol/L 乙酸铵溶液 （5.2.4），梯度洗脱 条件见表 1； c) 流速： 0.3 mL/min； d) 柱温： 40 ℃； e) 进样量： 2 µ L。 表1 梯度洗脱条件（ A：乙腈；B：5 mmol/L 乙酸铵溶液 ） 时间（ min） 流速（ mL/min） A（%） B（%） 0.0 0.3 90 10 0.5 0.3 90 10 1.5 0.3 50 50 3.5 0.3 50 50 4.0 0.3 90 10 6.0 0.3 90 10 8.3.2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾离子源（ ESI）； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测（ MRM），葫芦巴碱和 葫芦巴碱 -d3的MRM参数见表 2； d) 离子源温度： 120 ℃； e) 脱溶剂温度： 350 ℃； f) 脱溶剂气体流速： 650 L/h； g) 毛细管电压： 3 kV。 表2 葫芦巴碱及葫芦巴碱 -d3的多反应监测（ MRM）参数 化合物名称 定性离子对 （m/z） 定量离子对 （m/z） 锥孔电压 （V） 碰撞能量 （eV） 葫芦巴碱 138.0 /78.0 138.0 /92.0 50 22 138.0 /92.0 20 葫芦巴碱 -d3 141.0 /97.1 141.0 /95.1 50 20 141.0 /95.