ICS 67.050 CCS X89 中 华 人 民 共 和 国 供 销 合 作 行 业 标 准 GH/T 1396 —2022 GH 松花粉及其制品 中松源成分检测 实时荧光 PCR法 Identification of pine derived ingredients in pine pollen and its products — Real-time PCR method 2023 -02 - 09发布 2023 - 03 - 01实施 中华全国供销合作总社 发布 GH/T 1396 —2022 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中华全国供销合作总社 提出。 本文件由 全国蜂产品标准化工作组（ SAC/SWG2 ）归口。 本文件起草单位： 中国检验检疫科学研究院 、中检国控科技集团有限公司 、江苏蜂奥生物科技有限 公司、中国蜂产品协会 。 本文件主要起草人： 杨艳歌、张紫娟、刘鸣畅、吴亚君、 王洪越、 张羽、谭丽蕊、 王迎春、 范春林、 黄文胜、 李涛、李红娜、张佳琳。GH/T 1396 —2022 1 松花粉及其制品 中松源成分检测 实时荧光 PCR法 1 范围 本文件规定了松花粉 及其制品 中松源成分检测的实时荧光 PCR检测方法。 本文件适用于松花粉 及其制品 中松源成分的定性检测。 本文件的检出限（ LOD）为 1%（质量分数）。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 —2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 GH/T 1030 松花粉 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 花粉 pollen 由一个营养细胞和一个至二个生殖细胞组成的显花植物的雄性种质。 [来源： GB/T 30359 —2021，3.1] 3.2 松花粉 pine pollen 松花粉为 松科植物马尾松 Pinus massoniana Lamb .、油松 Pinus tabulaeformis Carr.或同属数种植物的 雄性生殖细胞。 [来源： GH/T 1030 —2004，3.1] 注： 包括采集产品和加工产品。 3.3 实时荧光 PCR real-time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个 PCR扩增过程，实现对起始 模板的定量及定性分析。 3.4 Ct值 cycle threshold value GH/T 1396 —2022 2 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（ Base pair） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（ Cetyltrithyl ammonium bromide ） dATP：脱氧腺苷三磷酸（ Deoxyadenosine triphosphate ） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（ Deoxycytidine triphosphate ） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（ Deoxyguanosine triphosphate ） DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic acid ） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（ Deoxyribonucleoside triphosphate ） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（ Deoxythymidine triphosphate ） EDTA：乙二胺四乙酸（ Ethylene diamine tetraacetic acid ） FAM：羧基荧光素（ Carboxyfluorescein ） OD：光密度（ Optical density ） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase chain reaction ） TAMRA：羧基四甲基罗丹明（ Carboxy -tetramethyl -rhodamine ） Taq：水生栖热菌（ Thermus aquaticus ） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（ Tris(hydroxymethyl)aminomethane ） UNG：尿嘧啶 N-糖基化酶（ Uracil N -glycosylase ） 5 方法原理 提取样品 DNA并以其为模板， 分别以 真核生物 18s rRNA 基因和松成熟酶蛋白 K（maturase K ，matK） 编码基因 设计引物和 Taqman探针，以松源 DNA为阳性对照，以原核生物 DNA为阴性对照，以无菌 水为空白对照， 进行实时荧光 PCR扩增，通过观察实时荧光 PCR的增幅现象， 判定样品中是否含有 松 源成分。 6 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用 无DNA酶污染的容器分装。 6.1 检测用引物和探针 松成分和内参基因扩增的引物和探针 信息详见表 1，松引物扩增的靶标序列见附录 A。 表1 松花粉中松源成分检测 引物探针序列 物种名称 引物 /探针序列 (5′→3′) 扩增片段长度 靶基因 内参基因 （真核生物） F: TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 137 bp 18s rRNA R: AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA P: FAM -CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC -TAMRA 松 F: GTTCGGACCAAAGATGGAAATAA 271 bp matK GH/T 1396 —2022 3 R: TCCCGTCTTAAACGATCCTCTC P: FA M-TCGTTGTCTCATGGATCTTTCCCTCAGC -TAMRA 6.2 三氯甲烷 (氯仿 )。 6.3 异丙醇。 6.4 蛋白酶 K缓冲液。 6.5 灭菌水：在 103.4 kPa （121 ℃）灭菌 20 min。 6.6 乙醇溶液（ 70%，V/V）。 6.7 蛋白酶 K（10 mg/mL ）：在 100 mg蛋白酶 K中加入 10 mL蛋白酶 K缓冲液，分装成 1 mL/管， -20 ℃储存。 6.8 NaOH溶液（ 10 mmol/L ）：在 160 mL二级水中加入 80.0 g NaOH 溶解后冷却至室温，再用二级 水补充至 200 mL。 6.9 Na2EDTA溶液（ 500 mmol/L，pH 8.0）：称取 18.6 g Na 2EDTA，加入 70 mL二级水，再加入 NaOH 溶液加热至完全溶解后，冷却至室温， NaOH溶液调 pH至 8.0，加二级水 补充至 100 mL，在 103.4 kPa （121 ℃）灭菌 20 min。 6.10 Tris-HCl溶液（ 1 mol/L，pH 8.0）：称取 121.1 g Tris 溶解于 800 mL 二级水，用 HCl调pH 8.0， 加二级水 补充至 1000 mL，在 103.4 kPa （121 ℃）灭菌 20 min。。 6.11 CTAB提取缓冲液（ pH 8.0）：称取 4.0 g CTAB ，16.364 g NaCl ，加入 20 mL 1 mol/L Tris -HCl 溶液（ pH 8.0），8 mL 500 mmol/L Na 2EDTA溶液（ pH 8.0），先用 70 mL 二级水溶解，再 补充至 200 mL，在 103.4 kPa （121 ℃）灭菌 20 min。 6.12 CTAB沉淀液：称取 1.0 g CTAB ，0.467 g NaCl ，先用 70 mL二级水溶解，再 补充至 200 mL， 在103.4 kPa （121 ℃）灭菌 20 min。 6.13 实时荧光 PCR反应混合液： 12.5 μL反应体系包括： 1 U～2 U（Unit， 酶学单位） 的 Taq酶、1× PCR 缓冲液、 2.5 mmol ／L～4.0 mmol ／L的Mg2+、0.2 U～1 U的UNG酶、0.2 mmol ／L的d (A，C，G)TPs、 0.2 mmol ／L～0.4 mmol ／L dUTP、400 nmol ／L ROX染料。也可使用等效的实时荧光 PCR预混液。 7 仪器设备 7.1 实时荧光 PCR仪。 7.2 超微量分光光度计 或紫外分光光度计。 7.3 组织研磨器。 7.4 冷冻离心机：离心力 ≥15000 g，制冷范围 -20 ° C～室温。 7.5 微量移液器： 0.5 µ L～10 µL，10 µ L～100 µ L，20 µ L～200 µ L，200 µ L～1000 µ L。 7.6 恒温混匀仪。 7.7 涡旋震荡器。 GH/T 1396 —2022 4 7.8